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专题15 基因工程
1、（2025 届河南省部分学校高三一模联考）SRY 基因是哺乳动物Y 染色体上具有决定雄性性别作用的
基因片段，常用作对移植前的胚胎进行性别鉴定，其过程如下：先从被测胚胎细胞中提取DNA 片段，然
后设计特异性引物并用胚胎细胞中的DNA 为模板进行PCR 扩增，最后用特异性探针(是一段带有检测标记，
能与目的基因互补的核苷酸序列)对扩增产物进行检测，该鉴定方法被称为SRY-PCR 法。下列对该方法的
分析，错误的是( )
A. 设计特异性引物和探针时需要用到SRY 基因的核苷酸序列
B. 扩增SRY 基因时，当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链
C. 当温度下降到72℃左右时，两种特异性引物会与互补的DNA 链结合
D. 用特异性探针对扩增产物进行检测时，若结果呈阳性，则检测个体为雄性
2、（2025 届河南省新高中创新联盟高三下学期模拟卷一） 下表是几种限制酶的识别序列及切割位点
（Y=C 或T，R=A 或G）。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶
HindⅡ
AluⅠ
BamHⅠ
Sau3AⅠ
识别序列及切割
位点
5'-
GTY↓RAC-3'
5'-
AG↓CT-3'
5'-
G↓GATCC-3'
5'-
↓GATC-3'
A. 限制酶切割一次需切断2 个磷酸二酯键，增加2 个游离的磷酸基团
B. 一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C. AluⅠ切割后的DNA 片段只可用E.coliDNA 连接酶连接
D. BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
3、（2025 届河南省郑州市郑东新区高三一模） 味精为有鲜味的物质，学名谷氨酸钠，是人们日常生活
中常用的调味品。谷氨酸是谷氨酸棒状杆菌有氧发酵的产物，是味精生产过程中不可缺少的关键环节。下
列相关叙述错误的是（ ）
A. 将淀粉和水调成淀粉乳，调节pH，加入淀粉酶搅拌可分解为葡萄糖
B. 发酵液经蒸煮、冷却后接种谷氨酸棒状杆菌进行发酵，需通入无菌空气
C. 通过辐射诱变处理可定向获得谷氨酸高产菌种，提高谷氨酸的产量
D. 将含有谷氨酸脱氢酶基因的重组质粒导入谷氨酸棒状杆菌可用Ca2+处理
4、（2025 届河南省驻马店市驿城区高三上学期一模） 将人抗体基因插入噬菌体DNA，然后让该噬菌体
感染大肠杆菌，表达的抗体可能和病毒蛋白以融合蛋白的形式，附着在噬菌体表面，也可能通过大肠杆菌
分泌出去。下列叙述错误的是（ ）
A. 可从人的B 细胞中获取总RNA，通过逆转录PCR 技术扩增出抗体基因
B. 为防止抗体被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞
C. 在把抗体基因导入受体细胞过程中，必须用Ca2+处理大肠杆菌
D. 通过该方法生产的抗体具有灵敏度高、特异性强的特点
5、（河南省名校联盟2025 届高三第六次联考一模）实验小组从苏云金芽孢杆菌中提取Bt 毒蛋白，注射
到小鼠体内使小鼠产生相应的抗体，再从转基因抗虫棉中提取蛋白质电泳分离后和抗体杂交，然后加入带
有特殊标记的抗体以显示出杂交带，具体过程如图所示，下列说法错误的是（ ）
A. 从转基因抗虫棉中分离出的蛋白质相当于抗原
B. 二抗可能是带有放射性同位素标记的一抗的抗体
C. 若未显示出杂交带，则说明目的基因未导入受体细胞
D. 图示操作的目的是检测转基因棉花是否产生Bt 毒蛋白
6、（2025 届河南省创新发展联盟高三下学期春季模拟检测）.羊乳价格比牛乳价格高。为防范市场上以
牛乳冒充羊乳销售的行为，研究人员以羊乳asl-酪蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确
的是（ ）
A. 利用抗asl-酪蛋白的单克隆抗体可以检测羊乳中是否掺杂了牛乳
B. 经高温破坏抗原结构的灭活病毒可诱导B 细胞与骨髓瘤细胞融合
C. 将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔可大量生产单克隆抗体
D. 杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖需要提供95％空气+5％CO2的混合气体
7、（2025 届河南省多地高三下学期3 月模拟联考） 内皮抑素是一种效果良好的新型抗癌药物，由胶原
XⅧ（广泛存在于肝脏中）降解产生。我国科学家研制出含转入内皮抑素基因的双歧杆菌口服液，口服
后，双歧杆菌在肠道定植、繁殖，其产生的内皮抑素活性片段在双歧杆菌死亡裂解后被吞噬、转运到肿瘤
组织发挥作用。下列叙述正确的是（ ）
A. 若要利用逆转录的方法合成内皮抑素基因，应从肌肉组织细胞中提取mRNA，因为肌肉细胞代谢旺盛
B. 利用PCR 技术扩增内皮抑素基因时，引物的设计不需要依据该基因的脱氧核苷酸序列
C. 使内皮抑素基因能在双歧杆菌中稳定存在并能表达和遗传，最关键的步骤是构建基因表达载体
D. 口服含转入内皮抑素基因的双歧杆菌口服液属于体内基因治疗
8、（2025 届河南省名校学术联盟高三下学期模拟冲刺）研究表明，组蛋白H3 赖氨酸4 甲基转移酶
（SMYD3）能通过使染色体组蛋白H3K4 发生甲基化来促进细胞增殖，具有促进牛体细胞重编程的作用，
shRNA 能下调其作用。为探讨其在猪体细胞核移植过程中的重编程作用，研究者进行有关实验（见图，
Fbs 是成纤维细胞；GFP 表达的绿色荧光蛋白可发出绿色荧光）。下列叙述正确的是（ ）
A. 利用Ca2+处理Fbs，可增大其吸收质粒的效率
B. 在传代培养猪卵母细胞时，要定期更换培养液
C. SMYD3 使囊胚染色体组蛋白甲基化来影响转录
D. 只能用shRNA 基因替换SMYD3 基因作为实验对照
9、（2025 届河南省豫西北教研联盟（洛平许济）高三下学期3 月二模）. 科研人员构建了可表达J-V5 融
合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5；该
重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水
平，结果如图乙所示。下列分析错误的是（ ）
A. 作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点
B. 为检测J 基因是否插入到图甲所示的位置，需用引物F1 和R1 进行PCR
C. 若J 基因转录的模板链位于b 链，则引物F2 与图甲中a 链相应部分的序列相同
D. 图乙中，条带1 的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了J-V5 融合蛋白
10、（2025 届河南省安阳市多校联考高三调研考试（一模））基因工程中，可利用报告基因（如增强绿
色荧光蛋白基因，EGFP 基因）与目的基因相连形成融合基因，用于鉴定目的基因是否在受体细胞中表达。
为培育抗冻的转基因番茄品种，研究人员设计了四种引物将多毛番茄的CBF1 基因与EGFP 基因通过融合
PCR 技术进行融合，如下图所示。回答下列问题：
（1）PCR 反应中引物的作用是使________从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。为使CBF1 基因与EGFP 基
因成功连接，应使引物R1 和F2________。
（2）利用重叠PCR 构建融合基因时，第一轮PCR 产生的DNA 链①～⑧中，________（填“能”或“不
能”）选取①和⑧进行组合。继续进行PCR 扩增后，产生的子链⑨～⑫中，子链相互连接后不利用引物即
可进行扩增的组合是________，理由是_________。
（3）引物F1 和R2 含有限制酶NcoI、BstEⅡ识别的序列，在引物中添加这两种限制酶识别序列的目的是
________。
11、（2025 届河南省安阳市高三一模） 外泌体是一种大小为30~100mm 的细胞外膜囊泡，尤其在癌症的
诊断及治疗等领域发挥重要作用。研究人员构建了含有近红外荧光蛋白iRFP682 基因和外泌体标记蛋白
CD63 基因的表达载体。载体构建过程中用到的限制酶的切割位点及部分过程如下图所示（AmpR表示氨苄
青霉素抗性基因）。请回答下列问题：
（1）为将CD63-iRFP682 基因与质粒进行准确和高效地连接，对CD63-iRFP682 基因、质粒分别用
________、________酶进行切割。基因表达载体中启动子的功能是________。
（2）PCR 扩增CD63-iRFP682 基因的过程中，设计的引物序列为________、________。若将该基因片段扩
增6 次，则消耗_______个引物分子。
（3）将构建好的基因表达载体通过适当的方式导入癌细胞。癌细胞培养过程中的pH 为______。检测该基
因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是_______。
（4）将目的基因导入大肠杆菌，提取其体内蛋白质注入兔子体内，进一步提取兔子体内的抗体，再与提
取的转基因癌细胞外泌体中的蛋白质进行杂交，然后进行电泳。若CD63-iRFP682 基因在癌细胞内表达，
电泳结果会出现特异性条带，此过程依据的原理是_______。
12、（2025 届河南省部分学校高三一模联考） 酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工
及生物燃料生产等。FLO 基因表达的FLO 蛋白可提高发酵中乙醇的产量，且FLO 蛋白量与乙醇产量呈正
相关。实验人员将FLO 基因与超表达启动子(能够显著提高基因的转录效率)连接以构建超表达载体(如图1
所示)，然后转入酿酒酵母细胞，以期获得高产乙醇的酿酒酵母品系。回答下列问题：
（1）采用酒精可将酿酒酵母细胞中的DNA 粗提取出来，其原理是___________，再通过PCR 扩增可获得
FLO 基因。
（2）图1 所示FLO 超表达载体中绿色荧光蛋白基因的作用是___________。
（3）实验人员根据超表达载体序列设计了图1 所示的引物1 和引物2.若所选用的引物越短，则会导致其特
异性___________(填“越低”或“越高”)。用引物1 和引物2 对非转基因酿酒酵母A 和转FLO 基因酿酒酵
母候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物的电泳结果如图2 所示，M 为标准参照物。其中，样品1 为本实验
的对照组，其作用是___________，样品2 有特异性扩增产物，表明___________。
（4）提取转基因酿酒酵母候选品系B 的FLO 基因转录所得的mRNA，以该mRNA 逆转录的DNA 为模板，
加入引物1 和引物2 进行扩增，___________(填“能”或“不能”)得到图2 中样品2 所示条带，理由是
___________。
13、（2025 届河南省洛阳市三校联考一模）随着世界人口的不断增长，粮食紧缺问题也日益严重起来，
为了缓解眼前的危机，转基因技术开始应用于粮食生产的领域。随着转基因植物商业化推广，转基因植物
的生物安全问题一直是人们争议的焦点，其中筛选标记基因是安全风险来源之一，因此作物转基因后删除
选择标记基因具有重要的意义。有报道发现，雌激素诱导的CRE/loxP 重组系统可以利用在加有雌激素的
条件下CRE 酶定位定向地删除转基因作物中位于2 个loxP 位点中的基因，使得2 个loxP 位点重组为1 个
loxP 位点。如下图：
回答下列问题：
（1）对转基因农作物进行安全评估不需要的是（ ）
A. 标记基因的安全性问题
B. 所用的启动子、终止子的安全性问题
C. 获得转基因作物的维生素含量
D. 对转基因农作物种植区域的选择
（2）某科研小组利用CRE/loxP 重组系统获得无筛选标记基因的转耐低磷G 基因的大豆，整个实验大体流
程如下图：
①根据GenBank 数据库上发表的某大豆G 基因的cDNA 编码区序列设计上、下游特异性引物，在设计引物
时，应在引物的______端添加特定限制酶的识别序列，其目的是_______。然后提取大豆子叶______为
PCR 模板。
②将氯化钙溶液___________后处理农杆菌，然后将含标记基因的重组Ti 质粒导入农杆菌。为了提高该转
化效率，需要考虑的因素有____________（答出2 点）。
③将无菌大豆子叶进行___________处理后与导入重组Ti 质粒的农杆菌进行共培养，培养适宜时间后，需
要将大豆子叶转移至添加有___________的培养基中进行筛选，获得成功转化的大豆子叶。将此大豆子叶
在相关培养基上进行___________得到大豆苗，并进一步培养获得种子。
④流程最后一步X 是指___________。具体操作是：将消毒的大豆种子接种在含有___________的MS 培养
基中培养一段时间，形成的大豆苗移栽至营养土中，提取大豆苗的___________进行PCR 检测。若仍能扩
增出完整的G 基因___________（“能/不能”）说明标记基因被成功切除，理由是：____________。
14、（2025 届河南省洛阳市三校联考一模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国
野生山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题：
Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种
（1）人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）葡萄植株进
行___、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的___，完成杂交。
（2）胚离体培养。杂交后7-10 天，剪取子房经75%乙醇或___消毒后，用___多次冲洗，用解剖针将其剥
开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。
Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D 基因的功能展开相关研究
（3）科研人员利用pG 载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4 基因的酵母AH109 菌株中，如下图
所示。GAL4 基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109 菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只
有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。
①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的___组，此外还需额外添加___，通过显色反
应做进一步验证。
A 组：加色氨酸和组氨酸
B 组：不加色氨酸和组氨酸
C 组：加组氨酸，不加色氨酸
D 组：加色氨酸，不加组氨酸
②实验结果表明抗寒相关D 基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实验结果。
对照组1：酵母菌导入pG-GAL4 重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。
对照组2：酵母菌导入___，实验结果：___。
实验组：酵母菌导入___，实验结果：___。
（4）将抗寒相关D 基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D 基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，
用含___的培养基筛选愈伤组织，用PCR 方法筛选出___植株，72 小时___诱导培养，检测植株中D 蛋白的
含量以判断抗寒能力。
15、（2025 届河南省洛阳市三校联考一模）回答下列（一）、（二）小题：
（一）葡萄柚汁多且营养丰富，在减肥、美容养颜、降低胆固醇、增强发质等方面都有功效，其鲜果和加
工品都深受消费者喜爱。
（1）柚子皮富含果胶，欲从柚子皮上分离纯化高产果胶酶的菌种，可在超净台上用接种环刮取柚子皮
（腐烂并长有霉菌）表面的菌体，用_________法将菌体接种到_________培养基上筛选纯化。
（2）以葡萄柚为原料采用混合菌发酵技术制作柚子醋的过程：葡萄柚去皮→榨汁→接种→果酒发酵→果
醋发酵→柚子醋。发酵过程中接种的是_________菌，需提供的氧气条件是_________，影响其产物风味的
因素除温度等环境因素外还有_________（至少写两点）。
（3）利用固定化细胞技术发酵效率更高，因为与固定化酶技术相比，该技术对酶活性的影响更小，原因
是_________。
（4）发酵结束后，发酵液常需进行_________处理，若滤液浑浊，可采取静置沉淀、加热或_________等
物理方法获得澄清果醋。
（二）新冠疫情威胁着人类的生命健康，疫苗的研制及病毒的检测在疫情防控中起着重要作用。新冠病毒
表面的S 蛋白是主要的病毒抗原。我国研发的腺病毒载体疫苗已获批上市。
（5）HEK 细胞是一种特殊的人胚胎肾源细胞，在该细胞中，质粒I 和质粒Ⅱ可进行同源重组，形成含S
蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒。对获得的重组腺病毒除用PCR 检测S 蛋白基因外，还需用_________方
法检测S 蛋白。
（6）使用非洲绿猴肾（Vero）细胞进行病毒培养扩增，然后将病毒灭活，再经过一系列处理得到灭活疫
苗。
经灭活的病毒保留了抗原成分，能诱导机体产生免疫应答。
①非洲绿猴肾（Vero）细胞培养通常需在合成培养基中加入_________。
②把新冠病毒毒株接种于Vero 细胞培养液，在适宜条件下培养，细胞出现病变时收获_________（填“细
胞培养液”或“Vero 细胞”），纯化后灭活。
（7）若机体接种腺病毒载体疫苗前感染过腺病毒，可能会减弱疫苗的免疫效果，其原因是_________。
（8）为能更早地在人群中发现病例，除核酸检测外，利用抗原检测试剂盒可居家自行检测。抗原检测试
剂盒的制备：取新冠病毒免疫过的动物B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经_________、克隆等途径获得单
克隆抗体，该单抗作为_________用于病毒抗原检测试剂盒。抗原检测虽然快速，但是检出率不及核酸检
测，原因是核酸检测有一个_________的过程，因此哪怕只有少量的病毒核酸也能被发现。
16、（2025 届河南省新高中创新联盟高三下学期模拟卷一）啤酒酿造中葡聚糖等物质会增加啤酒的粘度，
极易堵塞过滤装置，影响生产。某实验室采用转基因技术构建表达葡聚糖酶基因（GluZ）的工程酵母菌，
赋予了该酵母菌降解啤酒中葡聚糖的能力。图1 为实验中使用的质粒YE 的结构示意图，其中PGK 是酵母
菌的特异性启动子，ADH 为终止子，KnaMX 是遗传霉素抗性基因。MFα 是酵母菌特有的信号肽基因（信
号肽在分泌型蛋白的表达中具有重要作用），GluZ 需与MFα 连接形成融合基因，进而表达出分泌型蛋白。
融合基因的结构及相应限制酶的识别序列如图2 所示。回答下列问题：
（1）质粒YE 上PGK 的作用是_______。图1 中质粒YE 结构示意图未标出的必要元件是_______。
（2）为使MFα 与GluZ 连接形成融合基因，引物R1与引物F2的5´端都引入了NotI 的酶切序列。利用PCR
检测融合基因是否形成，可选用图2 中引物_______对连接产物进行扩增。
（3）对融合基因和质粒YE 分别酶切并连接后得到重组质粒，将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检
测发现融合基因（图3）转录、翻译出的蛋白质中只有信号肽的氨基酸序列（转录、翻译过程正确），请
结合图3，分析原因可能是：_______（已知终止密码子是UGA、UAG、UAA）。
（4）科研人员对（3）中的问题进行修正后，重新构建了重组质粒，将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表
达，检测发现融合基因转录、翻译出的融合蛋白质中信号肽的氨基酸序列正确，而GluZ 对应的氨基酸序
列却与葡聚糖酶不同。请继续结合图3 分析原因可能是：_______，具体修改方案是在扩增GluZ 使用的引
物F2的3´端_______（填“增加”或“减少”）1 个碱基。
17、（2025 届河南省新乡市高三一模）聚合酶链式反应（PCR），可用于目的基因的获取和扩增及目的
基因的检测等步骤中，另外利用PCR 技术还可以在目的基因两端添加某序列，相关过程如图所示。回答下
列问题：
（1）PCR 的每次循环一般分为三步，其中______所需的温度最高；PCR 能获取特定目的基因的关键是
______。
（2）β 链的______端为5'端，依据是引物与其模板链的方向______（填“相同”或“相反”），而DNA
聚合酶从引物的3'端开始沿______的方向延伸子链。
（3）为便于PCR 扩增的目的基因与表达载体连接，需要通过引物设计添加限制酶B 的酶切位点（如图中
过程①和②）；连接引物Ⅰ与序列X 需要用到______酶，至少需要经历______次循环才能得到含限制酶B
的酶切位点的双链产物。
（4）用于鉴定目的基因的PCR，______（填“能”或“不能”）利用图中引物Ⅰ和引物Ⅲ达到目的。
18、（2025 届河南省郑州市郑东新区高三一模） 几丁质酶可以催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的
水解，从而抑制真菌的生长繁殖，提高植物的抗真菌能力。通过基因工程将几丁质酶基因转入杨树体内，
可增强其抵抗真菌的能力。回答下列问题：
（1）为了便于目的基因与Ti 质粒的连接，在利用PCR 技术扩增目的基因时，需要在引物的____端（填
“5”或“3”）增加特定的限制酶切割位点。在两种引物上增加不同限制酶识别序列的主要目的是____（答
出两点即可）。
（2）受体农杆菌细胞在导入重组Ti 质粒前，需要先用Ca2+处理，其目的是____。形成的重组Ti 质粒需要
先导入农杆菌细胞，再侵染杨树的愈伤组织，理由是____。
（3）外植体（幼嫩的茎段）经过_____形成愈伤组织。在愈伤组织形成的过程中，导致外植体被污染的原
因可能是____（答出一点即可）。
（4）目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，首先需要通过分子水平的检测，其次，
还需要进行____水平的鉴定。
19、（河南省名校联盟2025 届高三第六次联考一模）蜘蛛丝被称为“生物钢”，其韧性是钢铁的5 倍，
可制成防弹背心、人造韧带、假肢等。蚕丝蛋白和蛛丝蛋白（MiSp）在结构上有一定的相似性，蚕丝蛋白
的主要成分有丝素重链（FibH）、丝素轻链（FibL）等，其中FibH 约占蚕丝蛋白含量的70%以上。实验
小组分别利用两种方案，构建能表达MiSp 的转基因家蚕。方案1：用FibH 基因的启动子、MiSp 基因和红
色荧光蛋白基因等构建重组基因表达载体，并用其转染家蚕受精卵，如图1 所示；方案2：敲除家蚕体内
FibH 基因的编码区，同时保留其上下游完整的调控序列，定点整合含MiSp 基因和红色荧光蛋白基因的
DNA 片段，如图2 所示。回答下列问题：
（1）图1 所示的基因表达载体中红色荧光蛋白基因的作用是___________；一般利用__________法将载体
导入家蚕受精卵中。
（2）比较两种方案，结果发现方案1 获得的转基因家蚕所结的茧中MiSp 含量仅占0.3%～3%，方案2 获
得的转基因家蚕所结的茧中MiSp 含量占比达35.2%，推测两种方案获得的转基因家蚕在MiSp 含量占比上
存在明显差异的原因可能是__________。
（3）科研人员发现，若将MiSp31 号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝的韧性可提高50%，根据这一研究结
果，可通过__________工程对MiSp 进行改造，并培育生产韧性更强的蛛丝的家蚕，请用文字和箭头写出
相关流程：__________。
20、（2025 届河南省创新发展联盟高三下学期春季模拟检测）.. 水蛭素（Hirudin）可预防和治疗血栓。
研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47 位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。如图表示改造Hirudin 基因及构
建基因表达载体的过程。回答下列问题：
（1）图中利用PCR 引物在Hirudin 基因内部引入碱基对的_______（填“增添”“缺失”或“替换”），需要在
______（填引物）中设计特定的碱基，从而对Hirudin 基因进行改造以获得改良的Hirudin 蛋白，这种技术
操作属于______工程。
（2）根据图中质粒pCLY11 的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11 与Hirudin 改良基因高效连接，
应选用_______对pCLY11 进行酶切。质粒pCLY11 中neor的作用是_______。
（3）若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用_______处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周
围环境中DNA 分子的生理状态。培养基中应加入新霉素，经过培养、筛选获得工程菌株，所选的工程菌
菌落应呈_______。
（4）若利用乳腺生物反应器生产改良的Hirudin 蛋白，请写出简要操作步骤：_______。
21、（2025 届河南省多地高三下学期3 月模拟联考）. 水稻基因组中的B 基因仅在体细胞和精子中正常
表达，在卵细胞中不能转录。为研究B 基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了如图所示的实验。回答
下列问题：
（1）构建表达载体时，将水稻B 基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc 基因拼接成B—Luc 融合基因，其目
的是________。表达载体中潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为______，可用于筛选含有表达载体的
水稻细胞。启动子是_______识别和结合的部位，能驱动基因转录。
（2）图中①过程常采用感受态细胞法，是利用________处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境
中DNA 分子的生理状态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，使T-DNA 整合到水稻细胞的_________
上。鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除了幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可以检测_____。
（3）若转基因植株中B 基因在卵细胞中正常表达，与野生型相比，其受精能力可能发生改变。为验证这
一推测，可进行杂交实验：让转基因植株作母本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置_________作为
对照，统计并比较_________。
22、（2025 届河南省开封市等3 地高三下学期二模） 出地盐碱化是农业生态环境退化的重大问题之一。
选育耐盐碱的优良品种可以保鞭国家粮食安全、提高土地利用效率和促进农业可持续发展、研究人员尝试
将OsCYP2 耐盐基因导入水稻中，以开发耐盐水稻新品种。回答下列问题。
（1）在本研究中，OsCYP2 耐盐基因属于______，获得后可通过______技术进行扩增。
限制
酶
识别序列
BamH
Ⅰ
5'-G↓GATCC-3'
XhoⅠ
5'-
G↓TCGAG-3'
PstⅠ
5'-
G↓TGCAG-3'
EcoRⅠ
5'-G↓AATTC-3'
SalⅠ
5'-G↓TCGAC-3'
（2）已知OsCYP2 耐盐基因的模板链为甲链，构建基因表达载体时，为了保证OsCYP2 耐盐基因与Ti 质
粒进行正确的拼接，需要用______酶处理OsCYP2 耐盐基因，用______酶处理Ti 质粒，再用DNA 连接酶
连接。
（3）利用Ti 质粒将OsCYP2 耐盐基因导入水稻细胞的方法是______。
（4）检测OsCYP2 耐盐基因在水稻细胞中是否稳定存在时，可用重组酶聚合酶扩增技术（简称RPA）进
行检测。RPA 技术主要依赖重组酶uvsX、单链结合蛋白Gp32、链置换DNA 聚合酶Bsu，其中重组酶
uvsX 能够在37℃-42℃时解开双链DNA.RPA 反应开始的时候，重组酶uvsX 结合单链DNA（引物），形
成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描（识别）与引物序列互补的目标双链DNA.接着，核酸蛋白复合
体侵入
端位点使DNA 双链打开。单链结合蛋白Gp32 与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶uvsX
离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA 聚合酶利用。之后，链置换DNA 聚合酶Bsu 结合在核酸蛋白复合体
的游离3'端，进行子链延伸。以上步骤循环进行，就可以实现DNA 的指数增长。其过程如图所示。
①用RPA 技术检测时，引物应与______相同。
②相对于PCR 而言，RPA 技术具有______、仪器依赖性低等突出优点，利于现场检测和即时诊断。
③通过优化______，可以进一步提高RPA 技术的特异性和灵敏性。
23、（2025 届河南省名校学术联盟高三下学期模拟冲刺） 牛可卡因—苯丙胺调节转录肽（CART）参与
摄食和体重调节、激素内分泌调节、感觉处理以及药物成瘾等相关生理功能。研究者在牛CART 基因的启
动子的﹣475bp～+22bp（转录起点为+1，下游为+，上游为﹣）处连接上pGL3 系列萤火虫荧光素酶基因
（LUC 基因）的编码区，并与牛CART 基因编码区拼接成融合基因（见图2；图1 则是相关基因结构；
LUC 可催化荧光素氧化发光）。
回答下列问题：
（1）结合图1、图2 可知，为实现融合蛋白的表达，研究者需剔除相关基因的某些片段，则剔除的片段及
其剔除的理由分别是______（答出1 种即可）。
（2）图2 所示实验的目的是______。
（3）牛CART 基因编码区是不连续的，其中含2 个非编码序列（内含子），内含子在转录后被剪切掉才
能形成mRNA，大肠杆菌没有该剪切机制。为保证融合基因能在大肠杆菌中形成融合蛋白，研究者在构建
上述融合基因时采用反转录PCR（RT - PCR），则验证融合基因的产生是不同RNA 剪接后逆转录产生而
非基因组DNA 融合而成的步骤是______。
（4）在生产融合蛋白时，研究者利用BamHI 分别处理含融合基因的DNA 片段和大肠杆菌质粒（如图3，
Ampr、Tetr分别是氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因），则培养基中添加的抗生素情况是______（填
“先用含四环素的培养基，后用含氨苄青霉素的培养基”或“先用含氨苄青霉素的培养基，后用含四环素
的培养基”），此外，培养基上还需包含的一般成分有______。
注：二次使用抗生素时，采用微生物影印法进行接种，该接种方法是一种在微生物学研究中广泛应用的技
术，主要用于在一系列培养皿的相同位置上接种并培养出相同的菌落，以便于后续的筛选和分析。
24、（河南省部分名校2024-2025 学年高三下学期3 月联考） 研究人员利用一种从某生物体内分离出的
抗盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中
正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①～⑥为不同过程，其中AmpR为氨苄青霉素抗性
基因，AluI、SmaI、HindⅢ和PstI 为限制酶。根据所学知识，回答下列问题：
（1）利用PCR 技术可获取大量目的基因，PCR 反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA
链上，设计两种引物的碱基序列时，要避免________；扩增时，需先加热至90～95℃，再冷却至55～
60℃，再加热至70～75°℃，进行系列温度调整的目的分别是_________。
（2）不用限制酶AluI 切割抗盐碱基因的原因是__________。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择
SmaI 和PstI 比只选择PstI 的优点是___________（答出两点）。
（3）图中②表示__________。诱导组织细胞脱分化的是__________号培养基。若要利用AmpR筛选出含重
组质粒的农杆菌，需要的操作是_________。利用Ti 质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈
伤组织细胞的理论依据是_____________。
25、（河南省部分学校2024-2025 学年高三下学期2 月联合性检测） 3-甾酮-9α-羟基化酶（KSH）是制备
甾体类药物的重要酶，其两个亚基KshA 和KshB 分别由基因MSMEG_5925 和基因MSMEG_6039 控制合
成。某科研小组从耻垢分枝杆菌的DNA 中通过PCR 方法分离出上述两种基因并构建了重组质粒，过程如
图所示。回答下列问题：
（1）图示PCR 扩增过程中，发生碱基互补配对
阶段是________（填序号），A、B 引物的设计需以基因
MSMEG_5925 和MSMEG_6039 的________为依据，而复性温度的设计与引物的________（答一点）有关。
（2）构建中间质粒时，先提取质粒pNIT 并利用限制酶________切割后对片段进行电泳，为了能在波长为
300nm 的紫外灯下检测出DNA 分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的________并混匀。
（3）构建表达质粒pNIT 一Mksh 时，科研人员在两个目的基因之间引入了SD（核糖体结合位点）序列和
间隔序列（CGGAGGAATCACTTCGCA）。SD 序列是原核生物mRNA 上的一段特定核苷酸序列，位于起
始密码子AUG 上游，其主要作用是提供核糖体结合位点，以确保________，从而提高翻译效率。间隔序
列的存在则可以避免______，确保它们能独立地被转录和翻译。
（4）将上述表达质粒导入大肠杆菌细胞中，涂布于含________的培养基中培养，挑取单菌落扩增目的基
因，_________（填“阳性”或“阴性”）菌落即为构建成功的工程菌。
26、（河南省部分学校2024-2025 学年高三下学期阶段测试（五）） MAP30 蛋白具有抗pvx 病毒的功能，
为培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科研团队构建重组质粒，利用农杆菌转化法将MAP30 基因导入
马铃薯细胞内，如图1 所示。根据所学知识回答下列问题：
（1）分析图1 可知，构建基因表达载体时宜选择_____酶识别并切割MAP30 基因和质粒。已知MAP30 基
因转录形成的mRNA 碱基序列为5'-UCAACGCUA……GUCGACUCG-3'，请写出利用PCR 扩增MAP30 基
因时所用的2 种引物序列：_____（各写6 个碱基即可）。
（2）G 蛋白和V 蛋白是转录激活因子，UAS 是诱导型启动子，据图2 判断UAS 启动子需要在_____条件
下被激活。质粒中含有5 个UAS 启动子，其作用可能是______。
（3）构建G-V-UAS 基因表达载体时采用仅在马铃薯叶片中驱动转录的启动子，可提高_____。要探究增
加转入的食品安全性，原因可能是MAP30 基因的数量是否会影响转基因马铃薯对除草剂A 的抗性程度，
请写出简要的实验思路：______。
27、（河南省部分重点高中九师联盟2024-2025 学年高三下学期2 月开学考试） 科研人员利用RT-PCR
技术获得的TaPRX-2A 基因构建的基因表达载体，成功培育出TaPRX-2A 基因能过表达的转基因耐盐玉米。
在培育过程中，所用的 Ti 质粒中的限制酶识别位点、标记基因等如图所示。其中，HindⅢ、PstⅠ、
EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ表示限制酶；AmpR为氨苄青霉素抗性基因，表达产物对氨苄青霉素有抗性；
LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；终
止子和启动子均能在玉米根细胞中调节基因表达。回答下列问题：
（1）用RT-PCR 技术扩增获得TaPRX-2A 基因的过程需要先经_______过程得到cDNA，再根据cDNA 设
计相应的引物，引物的作用是______。
（2）在构建含TaPRX-2A 的cDNA 的表达载体时，宜选用限制酶______对质粒和TaPRX-2A 的cDNA 进行
处理，将TaPRX-2A 的cDNA 插入质粒中相应酶切位点之间的原因是______（答两点）。
（3）获得转基因玉米时，先将含TaPRX-2A 的cDNA 的表达载体转入农杆菌，筛选含重组质粒的农杆菌
与玉米细胞共培养后，利用______技术将含TaPRX-2A 的cDNA 的受体细胞培养为转基因玉米。在这个过
程中，筛选含重组质粒的农杆菌时，需要在完全培养基中添加_______，挑选______色菌落。
28、（河南省项城市2024-2025 学年高三下学期3 月联考） 科研人员通过将温度诱导启动子及其阻遏元
件进行优化整合，构建了新型链霉菌温度诱导基因表达调控系统，如下图所示（所用不同限制酶的酶切位
点不同）。回答下列问题：
（1）图中TmsR 和tsp 的基本组成单位分别是______。
（2）构建图A 表达系统时，以小白链霉菌基因组DNA 为模板，用______（填“tmsRF/tspR”“tmsRR/
tspF”“tmsRR/tspR”或“tmsRF/tspF”，F、R 分别表示左右引物）扩增含有tmsR 和tsp 的DNA 片段。
（3）获得上述片段后用XbaⅠ酶切备用，人工合成neo 片段并用EcoRⅠ酶切，将两片段同时连入经______
酶切的质粒中，得到重组质粒，导入小白链霉菌中得到重组菌株，在含______的固体平板上进行培养并筛
选。
（4）在37℃条件下培养时，TmsR 不能与tmsO 结合，导致______，菌株正常生长；而在28℃培养时，
TmsR 与tmsO 结合，进而使菌株不能生长。若TmsR 含量不够，则可能存在一定程度的渗漏，即部分平板
上出现生长菌株。图B 为对该表达系统进行的初步改造，将PtmsR替换成强启动子PhrdB，推测这一替换的意
义是______。推测图C 中在tsp 附近增加tmsO 位点的作用是______。
29、（河南省驻马店市2024-2025 学年高三下学期2 月质量检测） 某研究小组提取大肠杆菌K—12 株的
基因组，通过PCR 扩增得到HT 基因（一侧带有BamH I 和EcoR I 双酶切位点），构建P2—HT 重组质粒
并融合从HIV 中分离的gP41 基因（编码HIV 抗原蛋白），实现了HT 基因和gp41 基因的融合表达，相关
过程如图所示。回答下列问题：
（1）用K—12 菌株基因组扩增HT 基因时，PCR 反应体系中一般需添加dNTP，其作用是______（答1
点）。若所用引物过长，则会导致退火温度______（填“过高”或“过低”）。引物
______（填“3＇”或“5
＇”）端还需添加限制酶的识别序列。
（2）获得的PCR 产物常通过______法进行鉴定。该操作中需将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具并插入合
适大小的梳子，其目的是______。
（3）MCS 是质粒上存在的一个人工合成的DNA 片段，其上有多个酶切位点，人工添加MCS 的意义是
______。质粒P2 的MCS 上至少有______种酶切位点。
（4）用P2—HT—gP41 质粒转化处于______生理状态的大肠杆菌，并涂布于含______的LB 平板上培养，
挑取单菌落用于后续实验操作。
30、（河南省驻马店市重点高中联考2024-2025 学年高三下学期3 月月考） 研究发现，酶A 能催化半纤
维素降解，使棉纤维长度变短。为培育转基因长绒棉花品种，科研人员构建了酶A 基因反义基因表达载体
（目的基因反向连接到载体中），过程如图所示，其中SmaI、NotI、HindIII 和BamHI 为酶切位点（四种
限制酶切割后黏性末端不同）。回答下列问题：
（1）大量获取酶A 基因的常用方法为_________，该方法的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶
中DNA 分子的迁移速率与凝胶的__________等有关。若酶A 基因两侧的碱基序列如下，请从①~④中选择
获取酶A 基因的引物组合__________。
5'-GAAGTCCTCT……ACGACGAACC-3'
3'-CTTCAGGAGA……TGCTGCTTGG-5'
①5'-GAAGTCCTCT-3'②5'-GGTTCGTCGT-3'
③5'-AGAGGACTTC-3'④5'-ACGACGAACC-3'
（2）图中构建的基因表达载体，使用的限制酶为_________时，构建出的基因表达载体既有正义基因表达
载体（目的基因正向连接到载体中）也有反义基因表达载体，原因是__________。可通过限制酶切割所产
生的DNA 片段长度区分上述两种载体，所选限制酶应为__________。
（3）利用农杆菌转化法将构建的反义基因表达载体导入棉花细胞，应先将反义基因表达载体导入
__________中，该过程利用的原理是农杆菌Ti 质粒上的__________可转移到被侵染的细胞中。反义基因表
达载体导入受体细胞后，通过抑制__________过程来影响酶A 基因的表达，进而影响棉绒的长度。
