专题16 基因工程
考点概览
考点01 重组DNA 技术的基本工具
考点02 基因工程的基本操作程序和应用
重组DNA 技术的基本工具
一、单选题
1．（2025·山东·二模）在DNA 提取过程中应尽量避免导致DNA 断裂和降解的各种因素，以保证DNA 的
完整性。下列操作与保证DNA 完整性无关的是（ ）
A．将洋葱切碎加入研磨液后再充分研磨
B．在上清液中加入预冷的酒精溶液
C．滤液在4℃冰箱中放置几分钟后再取上清液
D．加入酒精后用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌
2．（2025·江西赣州·二模）科研人员利用PCR 技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。下列叙述正
确的是（ ）
A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物
、
或引物
、
Ⅰ
Ⅳ
Ⅱ
Ⅲ
B．PCR 循环6 次可得到5 种DNA 分子，其中等长的DNA 分子共52 个
C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在-20℃储存，使用前在室温下解冻
D．鉴定DNA 时，应向提取的DNA 中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热
3．（2025·内蒙古·二模）CRISPR/Cas9 是一种基因编辑技术，作用机制如图。单链向导RNA 能特异性识
别并结合特定的DNA 序列，从而引导Cas9 蛋白到相应位置剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。下
列有关分析错误的是（ ）
考点01
A．该技术能精准识别相关基因的原理是碱基互补配对
B．Cas9 蛋白可催化脱氧核苷酸链上特定氢键的水解
C．人工设计特异性向导RNA 是基因编辑技术的关键
D．向导RNA 过短可能因不能准确识别，造成错误编辑
4．（2025·山东德州·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定
实验，下列说法正确的是（
”
）
A．PCR 过程中预变性与最后一次循环时，变性时间较长可使DNA 充分解聚
B．PCR 过程中，复性温度过低会导致无法扩增出DNA 片段
C．DNA 的电泳速率与DNA 分子的大小和构象有关，与凝胶浓度无关
D．将PCR 产物、核酸染料和凝胶载样缓冲液混合后，用微量移液器加入加样孔
5．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA 的粗提取与鉴定
和
”
“DNA 片段的扩增及电泳鉴定
实验的
”
叙述，错误的是（ ）
A．DNA 不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl 溶液
B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA 存在于上清液中
C．在凝胶电泳中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关
D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA 分子的结合，便于在紫外灯下观察
6．（2025·广东佛山·二模）某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA 粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下
列叙述正确的是（ ）
A．提取DNA 时，研磨后需用滤纸进行过滤
B．可利用DNA 在酒精中溶解度大的特点来提取DNA
C．琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D．若DNA 带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧
7．（2025·江西新余·二模）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R 蛋白（血凝素蛋白）密切相关，
现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R 蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶
切后的电泳结果。下列相关叙述正确的是（ ）
A．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、RNA 聚合酶、DNA 连接酶
B．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定
C．构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHI 在重组质粒上有2 个酶切位点
D．PCR 扩增R 基因中，微量离心管、枪头和移液器等在使用前均须消毒处理
二、多选题
8．（2025·江苏·二模）与DNA 相关的实验，下列叙述正确的有（ ）
A．利用DNA 在酒精中溶解度较大的特性提取DNA
B．粗提取的DNA 中可能含有蛋白质、脂质等杂质
C．用二苯胺试剂鉴定DNA 时，沸水浴加热后呈蓝色
D．PCR 扩增产物通常利用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定
9．（2025·河北张家口·二模）下列关于“DNA 粗提取和鉴定实验
与
”
“DNA 片段的扩增及电泳鉴定实
验
的叙述，正确的是（ ）
”
A．“DNA 粗提取和鉴定实验
中可能进行两次离心
”
B．在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色
C．在凝胶中DNA 分子的迁移速率与其构象无关
D．根据DNA 片段大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液进行鉴定
10．（2025·河北石家庄·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定
的实验，下列叙述错误的是（ ）
”
A．通过琼脂糖凝胶电泳可鉴定PCR 产物
B．待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时，需停止电泳以防DNA 跑出凝胶
C．PCR 利用了DNA 的热变性原理，一次PCR 一般要经历30 次循环
D．琼脂糖凝胶中的DNA 分子可直接在波长为300nm 的紫光灯下被检测出来
三、实验题
11．（2025·甘肃白银·二模）CRISPR/Cas9 基因编辑技术可用于基因敲除，其主要包含两种成分——Cas9
蛋白及小向导RNA（sgRNA），其作用原理如图1 所示。某科研团队利用该技术对拟南芥的Sv14 与Sv15
基因进行敲除，探究Sv14、Sv15 基因对拟南芥花粉育性的影响。请回答下列有关问题：
(1)将Cas9 蛋白及sgRNA 导入拟南芥细胞，我国科学家独创的一种方法是 。据图1 分析可知，Cas9
蛋白的功能相当于 酶。
(2)①为了提高敲除拟南芥的Sv14、Sv15 基因的成功率，一般先敲除其中一个基因获得单突变体，在此基
础上继续敲除另一个基因获得双突变体。已知拟南芥的Sv14、Sv15 基因模板链碱基序列如图2 所示。
请根据Sv14、Sv15 基因模板链碱基序列设计敲除Sv14、Sv15 基因过程中所用到起向导作用的sgRNA（若
sgRNA 为10bp，且选取模板链NGG 之前的序列设计，“N”表示任意核苷酸）。
Sv14—sgRNA：5′— —3'。
Sv15—sgRNA：5′— —3'。
为验证是否完全敲除，可提取待测拟南芥的总
②
DNA，加入 种引物进行PCR 扩增，PCR 产物长度
常采用 技术鉴定，理论上出现 种条带说明成功获得双突变体。
(3)对于成功转化的拟南芥植株还需进一步进行表型鉴定，研究人员选取不同转基因拟南芥采集花粉，观察
并计算花粉萌发率，结果见下表。
组别
野生
型
Sv14 突变
体
Sv15 突变
体
Sv14、Sv15 双突变
体
花粉萌发
率
95.0%
39.8%
80.0%
30.0%
根据以上表格，可得出的结论是 。为进一步验证这一结论，请用基因工程手段以Sv14、Sv15 双突
变体为材料设计实验并预测结果： （基因工程具体操作不做要求）。
基因工程的基本操作程序和应用
一、单选题
1．（2025·甘肃金昌·二模）反向PCR 是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程
如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．应选择引物1 和引物4 进行PCR 扩增
B．设计的引物中GC 碱基含量越高，复性时需要的温度越低
C．PCR 产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA 分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA 连接酶、耐高温的DNA 聚合酶及逆转录酶
2．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA 聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构
建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（ ）
A．表达载体中GUS 基因和LUC 基因转录时使用同一条DNA 单链为模板
B．为连入GUS 基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC 基因的质粒
C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞
D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果
3．（2025·广东清远·二模）新一代人工智能模型ESM3 首次实现了对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，
并成功
设计
出了一种全新的荧光蛋白，新荧光蛋白的生成相当于模拟了
“
”
5 亿年的进化过程。下列叙述
错误的是（ ）
A．人工智能模型ESM3 与蛋白质工程一样可以设计自然界没有的蛋白质
考点02
B．生物进化中产生的基因突变可为基因工程改造生物提供更多的基因资源
C．基因工程能够阻止生物进化过程中有害基因的出现，因为可以精准编辑基因
D．人工智能模型ESM3 可解码生物语言，因为自然界的生物体都有相同的遗传密码
4．（2025·广东清远·二模）某发光蘑菇可利用咖啡酸转化为荧光素，从而实现持续发光。科学家将蘑菇的
发光基因导入矮牵牛中培育出能持续发荧光的矮牵牛，且发现细胞代谢越旺盛的部位发光强度越大。下列
说法错误的是（ ）
A．可使用农杆菌转化法将荧光素酶基因导入到矮牵牛细胞中
B．矮牵牛导入了荧光素酶基因可发荧光，推测矮牵牛含有咖啡酸
C．可根据植株在不同时间的发荧光强度监测植物的动态发育过程
D．通过基因工程技术获得的发荧光矮牵牛属于新物种
5．（2025·江西赣州·二模）科研人员利用PCR 技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。下列叙述正
确的是（ ）
A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物
、
或引物
、
Ⅰ
Ⅳ
Ⅱ
Ⅲ
B．PCR 循环6 次可得到5 种DNA 分子，其中等长的DNA 分子共52 个
C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在-20℃储存，使用前在室温下解冻
D．鉴定DNA 时，应向提取的DNA 中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热
6．（2025·山东泰安·二模）结肠癌是发病率高的癌症之一，患者血清中的M 蛋白含量显著降低，据此推
测M 基因可能是一种抑癌基因。研究人员利用数据库筛选到一种可促进M 基因转录的E 蛋白。推测E 蛋
白通过与M 基因启动子区域结合，促进M 基因的表达。将相应质粒分别转入两组相同的细胞中，一段时
间后收集细胞裂解液，检测荧光强度。结果显示甲组荧光强度明显高于乙组，从而证实推测。请从下列选
项中选择转入甲组细胞和转入乙组．细胞的表达载体（ ）
A．ac af
B．bc bf
C．bd be
D．ad ae
7．（2025·江苏南京·二模）生物技术与工程学相结合，可研究、设计和加工生产各种生物工程产品。下列
叙述错误的是（ ）
A．二倍体植株的花药离体培养得到的单倍体植株可用于基因突变的研究
B．由iPS 细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
C．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR 产物混合后滴入加样孔指示电泳进程
D．大量制备一种单克隆抗体时需要用大量的B 细胞和骨髓瘤细胞进行融合
8．（2025·山东泰安·二模）科学家利用动物乳腺生物反应器生产某病毒的N 蛋白，用于制备该病毒的疫苗，
基本流程如图。下列相关叙述错误的是（ ）
A．精子获能后才可受精，卵细胞通过透明带反应和卵细胞膜反应来防止多精入卵
B．过程
在基因工程中为核心步骤，甲为基因表达载体，过程
需提供无菌无毒环境
①
②
C．过程
将囊胚移植入代孕羊驼之前，需用促性腺激素对代孕母羊驼进行同期发情处理
③
D．欲获得转基因母羊驼，需在胚胎移植前取滋养层细胞做DNA 分析鉴定性别
9．（2025·北京海淀·二模）为合成出局部为双链的RNA 用于沉默特定基因，先将目的基因X 从重组质粒
pHIBS 切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST 中，如下图，其中质粒只展示了局部。
下列叙述正确的是（ ）
A．该操作过程中还需要DNA 连接酶和耐高温的DNA 聚合酶
B．利用B 和Bg、S 和Xh 黏性末端相同，实现基因X 与pUAST 连接
C．基因X 的DNA 片段需要完整保留启动子和终止子区域
D．可以用E 和Bg，或者Xh 和K 双酶切重组pUAST
10．（2025·山东青岛·二模）DNA 足迹法是检测DNA 序列中结合蛋白识别部位的一种方法。DNA 与蛋白
质结合后，由于蛋白质的保护，DNasel 酶无法对这一部位进行切割，可以运用此方法来确定启动子在
DNA 序列中的具体位置。某DNA 片段上具有一个启动子，为研究其位置，研究小组决定用DNA 足迹法
对其进行检测。DNA 片段上的DNasel 酶酶切位点及各部分的长度如图1 所示。对照组和实验组均加入等
量的待测DNA 样液，然后加入等量的DNasel 酶，通过控制酶的用量和作用时间使每个DNA 分子只发生
一次磷酸二酯键的断裂。酶解后将对照组和实验组分别进行电泳检测所得片段的大小，对照组得到大小分
别为10bp、40bp、50bp、90bp、100bp、140bp、150bp、180bp 的8 个片段，实验组得到大小分别为
10bp、50bp、90bp、100bp、140bp、180bp 的6 个片段。下列说法正确的是（ ）
A．构成启动子的基本单位是脱氧核苷酸，启动子的功能是与DNA 聚合酶结合，启动转录
B．根据实验结果可以确定，启动子在DNA 上的位置为A 点附近
C．DNasel 酶可作用于DNA 的氢键和磷酸二酯键
D．为使结果更直观呈现，在DNA 一端用
12P 进行标记，若标记在a 端，则结果如图2 所示
11．（2025·山东青岛·二模）普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通
水稻高60%的转基因水稻。图1 为改良基因及Ti 质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ
基因及一些酶切位点，图2 为后续培养过程。下列说法正确的是（ ）
A．需用限制酶XmaI 和NheI 对Ti 质粒进行切割
B．培养基2 与培养基3 加入的生长素和细胞分裂素比例不同
C．在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中一定含有改良基因
D．筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入β-半乳糖苷，目标菌落为蓝色
12．（2025·山东泰安·二模）染色体上的端粒DNA 由短的串联重复序列组成，同种生物的该序列相同。少
数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。ALT 机制如下：第一条染
色体端粒的末端
链结合到第二条染色体端粒的末端
链上并延伸；随后
链脱离，在
①
②
①
RNA 引物和DNA
聚合酶的作用下，新延长的
链被转化成双链形式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒
①
传递到另一端粒上。下列说法错误的是（ ）
A．
链的延伸过程以
链作为模板，该过程不需要合成引物
①
②
B．DNA 聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短
C．进行ALT 的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高
D．非同源染色体间通过ALT 机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性
13．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA 聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构
建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（ ）
A．表达载体中GUS 基因和LUC 基因转录时使用同一条DNA 单链为模板
B．为连入GUS 基因，需用Sal I 和Sph I 酶切已整合了双向启动子及LUC 基因的质粒
C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞
D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果
14．（2025·重庆·二模）β-半乳糖苷酶由lacZ 基因编码，能将无色的X-gal 分解为蓝色物质。将lacZ 基因
分成两段，分别放在质粒（如图）和受体菌中，表达出的两条肽-a 肽和ω 肽通过非共价键结合仍有相同的
酶活性。在含有氨苄青霉素、X-gal、IPTG（诱导lacZ 基因表达）的LB 培养基上培养转化后的受体菌。下
列说法正确的是（ ）
A．所有未转化菌株均能生长且呈白色，重组质粒转化的菌落呈蓝色
B．转化失败的菌落呈白色，空载体转化的菌落呈蓝色，重组质粒转化的菌落呈白色
C．转化失败的菌株无法生长，空载体转化的菌落呈蓝色，重组质粒转化的菌落呈白色
D．转化失败的菌株无法生长，空载体转化的菌落呈白色，重组质粒转化的菌落呈蓝色
15．（2025·山东聊城·二模）下列关于生物技术与工程的实验操作，错误的是（ ）
A．将配制的酵母培养基高压蒸汽灭菌后，需要在酒精灯火焰旁倒平板
B．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
C．利用添加核酸染料的凝胶对PCR 产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
D．配制PCR 反应体系时，加入等量的4 种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料
16．（2025·山西太原·二模）反向PCR 是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术，需要先将目标
DNA 进行环化，再以环化的DNA 为模板进行扩增。现利用反向PCR 技术来确定目的基因的插入位点，部
分过程如下图所示，相关叙述正确的是（ ）
A．过程
中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物
②
2 和3
B．过程
中复性是在
③
72℃左右使两种引物与模板链结合
C．过程
所用的酶从引物的
③
3'端开始连接脱氧核苷酸
D．PCR 第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列
17．（2025·河北邢台·二模）研究人员将胰岛素B 链的第28 位氨基酸替换为天冬氨酸，抑制了胰岛素聚合，
从而获得速效胰岛素类似物。下列叙述正确的是（ ）
A．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程相反
B．可通过定向诱导胰岛素基因碱基增添达到改造目的
C．改变氨基酸的种类不会影响胰岛素的空间结构
D．该产品是通过直接改造胰岛素来生产的
18．（2025·重庆·二模）下图为科研人员培育双抗性（抗虫和抗草甘膦）转基因烟草的部分过程示意图。
下列说法错误的是（ ）
注：“Cry1Ac-2．5”表示人工合成杀虫基因，“GR79 EPSPS”表示草甘膦抗性基因，“Ω”表示增强基因表
达的序列。
A．图中的
结构是
①
RNA 聚合酶识别和结合的部位
B．双抗性烟草培育过程中抗草甘膦基因作为标记基因筛选重组 DNA
C．图中
转基因植株
一定具有抗草甘膦和抗虫的特性
“
”
D．构建植物表达载体的过程中需要使用限制酶和 DNA 连接酶
19．（2025·甘肃白银·二模）关于“DNA 的粗提取与鉴定
和
”
“DNA 片段的扩增及电泳鉴定
的实验操作
”
，
下列说法错误的是（ ）
A．取洋葱研磨液的上清液，加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为 95%），离心后管底的
沉淀物为粗提取的DNA
B．将提取的白色丝状物溶于2mol/L 的NaCl 溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA
C．电泳鉴定实验中，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具后再加入核酸染料
D．电泳时，接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
20．（2025·四川广安·二模）如图为人类胚胎发育到第6 周和第12 周时两种珠蛋白基因的表达情况。下列
叙述正确的是（ ）
A．DNA 甲基化不会改变生物的基因型和表型
B．胚胎发育的过程中，DNA 甲基化是可逆的
C．胚胎发育的不同阶段，基因表达情况是完全不同的
D．启动子甲基化可能导致DNA 聚合酶不能识别和结合
21．（2025·甘肃·二模）基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速。下图表示利
用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述错误的是（ ）
A．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA 聚合酶从引物a、b 的3 端进行子链合成
B．目的基因要与能在绵羊乳腺细胞中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起
C．若目的基因是从人的细胞内提取mRNA 经逆转录形成的，则该目的基因中不含启动子序列
D．可以利用农杆菌转化法将含有目的基因的重组质粒直接整合到受体植物细胞的染色体DNA 上
22．（2025·浙江杭州·二模）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同
识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述错误的
是（ ）
限制酶的名
称
识别和切割位
点
HinPⅡ
5-G↓CGC-3'
GlaⅠ
5-GC↓GC-3'
HhaⅠ
5-GCG↓C-3'
HpaⅡ
5'-C↓CGG-3'
NarⅠ
5'-GG↓CGCC-3'
A．HinP1I 和HhaI 为同裂酶，切出的黏性末端不同
B．HinP1I 和HpaII 切割的产物连接后，其序列不能被GlaI 切割
C．HinP1I 和NarI 为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaI 切割
D．某质粒仅含1 个GlaI 的识别位点，则该质粒能被NarI 切割的概率为1/16
23．（2025·山西临汾·二模）目的基因A 含有100 对碱基，其中腺嘌呤占30%，现利用目的基因A 片段两
侧的特异性序列设计引物I、引物
，用
Ⅱ
PCR 技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR 扩增共循环50
次。下列说法错误的是（ ）
A．PCR 仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50 次理论上复制50 代
B．含目的基因A 的DNA 片段经PCR 循环50 次，需要两种引物共250个
C．PCR 过程与体内DNA 复制的方式相同，但是只需要一种酶的参与
D．若只考虑目的基因A，经PCR 循环50 次需要鸟嘌呤(250-1)×40 个
24．（2025·安徽池州·二模）DREB1A 是克隆自拟南芥的逆境诱导转录因子，可以调控多个与植物干旱、
高盐及低温耐性有关的功能基因表达。某科研小组通过实验研究以花生茎尖细胞作为 DREB1A 基因受体
的可行性。下列叙述错误的是（ ）
A．用 PCR 技术扩增DREB1A 基因,扩增n 次需要引物2ⁿ⁺¹-2 个
B．该实验是利用基因重组原理将DREB1A 基因整合到花生基因组
C．该实验应选择合适的启动子以驱动DREB1A 基因的复制和转录
D．该实验可以利用农杆菌转化法将DREB1A 基因导入花生茎尖细胞
25．（2025·四川宜宾·二模）如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备
基因工程菌
的示意图，其中引物
“
”
1-4 在含有目的基因的DNA 上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindIII 在质粒上的识别位
点如乙图所示。以下叙述错误的是（ ）
A．PCR 过程完成4 轮循环，理论上至少需加入引物30 个
B．过程
中不能同时使用限制酶
①
EcoRI 和BamHI 切割质粒
C．在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌就是此过程制备的工程菌
D．若已经合成了图甲所示4 种引物，应选择引物1 和4 扩增目的基因
26．（2025·贵州毕节·二模）某小组利用PCR 扩增某目的基因，设计了引物A 和引物B。下列相关叙述错
误的是（ ）
A．经过二轮循环后的产物中只含有引物A 的DNA 片段所占的比例为1/4
B．经过三轮循环后的产物中含有引物B 的DNA 片段所占的比例为1/2
C．经过四轮循环后的产物中同时含有两种引物的DNA 片段所占的比例为7/8
D．耐高温的DNA 聚合酶从引物的3'端延伸子链
二、多选题
27．（2025·山东·二模）Ti 质粒的Vir 基因表达产生的Vir 蛋白能在T-DNA 左右边界序列中产生切口，并
复制出单链T-DNA 从Ti 质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA 利用左右边界序列与植物细胞DNA 分子中
某些序列有极强的同源性，插入植物细胞基因组中。T-DNA 的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织
过度生长，形成瘤状组织（冠瘿），冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，为农杆菌的生长提供
碳源和氮源。下列说法错误的是（ ）
A．Ti 质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA 整合后，其表达产物可将冠瘿碱分解
B．为保证转基因植物正常生长，Ti 质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除
C．应将目的基因插入Ti 质粒的T-DNA 上，且不能破坏左右边界序列
D．Ti 质粒作为基因工程载体时，需将Vir 基因替换成标记基因，用于重组DNA 分子的筛选
28．（2025·江西赣州·二模）2025 年3 月，我国科学家成功将利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统改造后的猪
肝脏移植入人体。该基因编辑系统主要包括向导RNA（crRNA 和tracrRNA 组成的复合体）和Cas9 蛋白。
crRNA 含有与靶基因片段配对的序列，与tracrRNA 共同协助Cas9 蛋白准确定位，进行如图所示的基因编
辑。下列叙述正确的是（ ）
A．为降低排异反应，需敲除猪抗原基因，并使用免疫抑制剂降低细胞免疫水平
B．crRNA 特异性识别目标DNA 分子，敲除猪抗原基因时至少要设计两种crRNA
C．通过缩短crRNA 来提高其特异性，可降低因错误结合而出现
脱靶
的概率
“
”
D．CRISPR/Cas9 系统工作时，Cas9 蛋白具有专一性，可作用于氢键和磷酸二酯键
29．（2025·江西鹰潭·二模）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，随着转基因技术与动物细胞工程结合
和发展，我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
构建乳腺专一表达载体，
表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（
①
②
BEF），
核移植，
重组细胞的体外培
③
④
养及胚胎移植，
检测。下列说法正确的有（
⑤
）
A．将获得的高产赖氨酸的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建基因表达载体
B．将表达载体通过农杆菌转化将含有目的基因的T-DNA，整合到BEF 细胞核的染色体的DNA 上
C．将转基因的BEF 与去核卵母细胞用灭活的病毒激活形成重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程
D．重组细胞体外培养至早期胚胎，将胚胎移入代孕母牛子宫，最终生出高产赖氨酸转基因克隆奶牛
30．（2025·河北·二模）图甲表示限制酶切割某双链DNA 分子的图示，其中Y 为某种限制酶，X 表示切割
的DNA 长度，限制酶对应切点一定能切开。图乙表示图甲相应酶切产物电泳分离结果。下列相关叙述错
误的是（ ）
A．若经电泳分离后图乙没有相应电泳条带，则是PCR 中延伸温度太高所致
B．由图可知，限制酶A、限制酶B 分别酶切产生的黏性末端的碱基能互补配对
C．根据图乙中酶切电泳分离结果可推测，Y 为限制酶B，X 长度为4500bp
D．限制酶A 酶切电泳结果与图乙中的
相符，限制酶
①
B 酶切电泳结果与图乙中的
相符
②
31．（2025·江西南昌·二模）传统抗蛇毒血清（抗体）生产成本很高，对蛇毒毒素的疗效有限。研究人员
利用AI 技术从头设计蛋白质以中和蛇毒毒素，成功设计出两种能够有效中和神经毒素的结合蛋白。下列
说法正确的是（ ）
A．传统抗蛇毒血清的制备依赖于动物免疫反应，产量低、纯度低且特异性差
B．利用AI 技术设计的神经毒素结合蛋白与传统抗蛇毒血清的化学本质不同
C．AI 技术可以模拟和计算结合蛋白与蛇毒毒素的结合位点，预测蛋白结构
D．AI 技术的运用大幅度缩短传统实验设计的周期，减少试错实验的耗材
32．（2025·黑龙江哈尔滨·二模）端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA 复制方式
有关。人体细胞内DNA 复制部分过程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．图示体现了边解旋边复制、DNA 半保留复制的特点
B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除，形成
空白
区域
“
”
C．PCR 过程中用到的A 酶具有耐高温的特点
D．据图可推测端粒缩短的原因可能与新合成的子链5'端变短有关
33．（2025·江西九江·二模）下图A、B 所示为Ti 质粒和含S 基因的DNA 片段及一些酶切位点，图中所示
的限制酶切割位点及其所产生的末端都不相同。下列说法正确的是（ ）
A．最好选用XbaⅠ和Hind Ⅲ切割含S 基因的DNA 片段和Ti 质粒
B．PCR 扩增S 基因时，引物结合在S 基因两条链的5'末端
C．S 基因应插入到Ti 质粒T—DNA 的启动子与终止子之间
D．基因工程中使用的各种限制酶切割DNA 所形成的末端都不相同
34．（2025·黑龙江·二模）皂苷是分布广泛且结构复杂的天然产物，具有多种生物活性。乙酰化是皂苷最
常见的修饰之一，对提高其生物活性起着重要作用。皂苷乙酰化最有可能由酰基转移酶（ATs）催化，天
然的ATs 催化效率较低，研究人员利用蛋白质工程技术改良了ATs，大大地提高了其催化效率。下列叙述
正确的是（ ）
A．该技术不能通过直接改造ATs 的结构来提高其催化效率
B．根据ATs 的氨基酸序列就能准确推出相应的脱氧核苷酸序列
C．该技术的实施需要限制酶、DNA 连接酶以及载体等工具
D．该技术难度很大，因为蛋白质发挥功能必须依赖复杂的空间结构
35．（2025·江苏淮安·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定
实验，下列说法正确的是（ ）
”
A．根据 DNA 片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA 分子
B．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来
C．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
D．扩增得到的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
三、解答题
36．（2025·北京朝阳·二模）学习以下材料，回答（1）～（5）题。
小环大威力：ecDNA 在癌症发生和进展中的作用
细胞中可能由于染色体断裂和重新连接，形成游离于染色体外的环状DNA 分子，称为ecDNA。细胞周期
中，ecDNA 复制后随机分配给两个子细胞。
含原癌基因的ecDNA 的产生概率极低，但临床调查发现约17.1%的癌症患者癌细胞中存在携带原癌基因的
ecDNA。为构建与癌细胞中类似的ecDNA，研究者将两段含loxP 位点和标记基因的外源DNA 插入12 号
染色体，再用Cre 酶处理．使染色体中的一个片段脱落并环化，形成含原癌基因MDM2 的ecDNA（图
1）。
处理后同时发出绿色和红色荧光的细胞即为含有/ecDNA 的细胞，称为ec 细胞。研究者对ec 细胞进行传代
培养，发现其后代中丢失绿色荧光的细胞比例逐渐增加。推测由于细胞分裂中ecDNA 随机分配，产生不
含ecDNA 的子细胞，且这些子细胞在适宜环境中继续增殖；如果培养环境改变为ecDNA 能为细胞带来更
强适应能力的环境，则子代中ec 细胞比例会增加，ec 细胞中ecDNA 的拷贝数也会增加。为检验假设，研
究者将上述ec 细胞分别放在含不同浓度潮霉素的培养基中培养，结果表明，潮霉素处理能够增加子代中ec
细胞占比和ec 细胞中ecDNA 拷贝数。
为进一步研究ecDNA 在体内的作用，研究者在小鼠肝细胞中诱导生成含有MDM2 基因的ecDNA。小鼠肝
脏中迅速出现癌细胞，形成肿瘤。
ecDNA 的工程化构建为研究其致癌机制提供了新工具，未来有可能成为癌症精准治疗的靶点。
(1)eeDNA 缺少着丝粒，因此复制后的ecDNA 不能在 的作用下均分给两个子细胞。
(2)ecDNA 的染色质状态更开放，其上的MDM2 基因表达量 ，能促进细胞癌变和已癌变细胞的增殖。
(3)研究者进行外源DNA 插入操作后，用含 的培养液筛选出成功插入的细胞。
(4)Cre 酶可以将DNA 上两个相同loxP 位点之间的片段切割后环化（图2）。用Cre 酶处理已插入片段1 和
片段2 的12 号染色体（图3），产生图1 所示ecDNA。请写出片段2 上各字母代表的表达元件。
(5)请根据潮霉素培养实验和小鼠肝细胞诱导实验推测携带原癌基因的ecDNA 在癌细胞中广泛存在的原因
。
37．（2025·山东·二模）水稻中WRKY 基因编码的WRKY 是一种由60 个氨基酸残基组成的转录因子，与
水稻细胞的RABZ1 基因启动子结合，调节RABZ1 基因的表达，从而影响水稻的抗旱能力。科学家欲探究
WRKY 对RABZ1 基因表达水平的影响，进行了相应实验。已知W-box 是RABZ1 基因启动子区域的一段
DNA 序列，是WRKY 结合的位点。HA 蛋白为标签蛋白，可通过抗HA 抗体对目标基因的表达情况进行检
测。请完成下列问题。
(1)若WRKY 基因的b 链为转录的模板链，结合图1 分析，为使该基因与载体定向连接，需要使用的限制
酶是 。
注：HPT 基因是潮霉素磷酸转移酶基因。能解除潮霉素对细胞的毒性
(2)研究人员根据RABZ1 基因上游的启动子序列设计了F1、F2、R1、R24 种备选引物，用于扩增含有W-box
的调控序列，如图2 所示。为选出正确和有效的引物，以RABZ1 基因上游的启动子序列为模板进行PCR
扩增，将扩增产物进行电泳结果如图4 所示。
利用PCR 获取RABZ1 基因上游的W-box 序列应选择的引物组合是 。为将RABZ1 基因上游的
W-box 序列定向接入载体中，两种引物还应做如何设计？ 。据图分析设计不成功的引物和特异
性差的引物分别是 。
(3)欲检测WRKY 对RABZ1 基因表达水平的影响，应先在含 的培养基中培养受体细胞，再利用
抗HA 抗体检测细胞中相应蛋白的含量。仅据此依然无法得出WRKY 对RABZ1 基因表达水平的影响，原
因是 。
(4)探究WRKY 对RABZ1 基因表达水平的影响时，是否能选择水稻细胞作为受体细胞？ （填
是
或
否
），原因是
“
”
“
”
。
38．（2025·江苏·二模）人类血液中的纤维蛋白原是血液凝固的主要蛋白质成分，由Aα、Bβ 和γ 三条肽链
组成，重组人纤维蛋白原（rFib）的开发有望消除血源性感染的风险。某科研团队欲通过培育转基因蚕并
利用蚕茧高效生产人纤维蛋白原，流程如下图。请回答下列问题。
(1)纤维蛋白原的Aα、Bβ 和γ 链首先在 上合成，然后Aα 和γ 链在内质网中与Bβ 链结合形成的六聚
体Aα2Bβ2γ2，最后在 中加工修饰并分泌到细胞外。
(2)选取从人类肝脏的cDNA 文库扩增目的基因的原因是 ；步骤①PCR 条件如下：94℃，5min→25
个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，其中退火温度设置需参考引物中碱基的 ，延伸阶段使
用ExTaqDNA 聚合酶，该酶的作用有 和在扩增产物的3'端额外添加上一个碱基“A”。
(3)步骤
中，将
②
Fib-Bβ 插入到 （填“3'”或“5'”）端含有碱基T 的克隆载体中，将克隆后的Fib-Bβ
用 限制酶处理后通过DNA 连接酶连接到表达载体上完成载体1 的构建。载体2 采用类似方法构建。
(4)步骤
分别将载体
③
1 和载体2 注入胚盘期蚕卵中，在荧光体视显微镜下观察 在眼部的表达，显示
阳性表达的即为转基因Bβ-蚕和转基因Aα/γ-蚕。对转基因蚕进行DNA 杂交分析表明，Bβ-蚕和Aα/γ-蚕均
存在多个转基因品系，这可能与插入的目的基因数量和 有关。
(5)丝胶蛋白启动子将重组纤维蛋白原链的cDNA 定向表达在丝腺细胞中，然后依靠吐丝分泌到蚕茧中。科
研人员对丝腺细胞中的mRNA 进行检测并对蚕茧中的蛋白质进行分析，结果如下表。
组别
mRNA
蛋白质电泳条
带
Aα 链
mRNA
Bβ 链
mRNA
γ 链
mRNA
Aα
Bβ
γ
非转基因蚕（对照
组）
-
-
-
-
-
-
转基因Bβ-蚕
-
+
-
-
-
-
转基因Aα/γ-蚕
+
-
+
+
-
+
转基因Aα/Bβ/γ-蚕
+
+
+
+
+
+
注：“+”表示有，“-”表示无
根据实验结果推测， 可能是Bβ 链分泌到蚕茧中的必要条件之一。
39．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1 产生
的LA1 酶可耐高温，菌株2 产生的LA2 酶具有高催化效率，且LA1 基因和LA2 基因具有93%的同源性。
研究人员采用交错延伸PCR 技术获得了重组LA 基因，生产出了更高效的酶。
(1)交错延伸PCR 技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2 均做
模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程
起始引物片段均为
①
25 个核苷酸，
TaqDNA 聚合酶延伸速度为1200 个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s、复性15s、延伸15s，
经过80 轮交错循环后，可获得PCR 混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。
(2)获得的重组LA 基因中，同时只有LA1 和LA2 基因序列的原因是 。
(3)过程
用到的
②
PM 质粒中A 为启动子、B 为氯霉素抗性基因cat、C 为终止子、D 为asd-突变基因、E 为
复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd 基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP 合成途径的关键
酶，asd 基因缺失时，将导致菌株生长对DAP 依赖。为使目的基因定向插入PM 质粒，交错延伸PCR 过程
中引物的5'端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程
中应采用
③
asd 基因
的受体菌。从含有PM 质粒、重组PM 质粒的受体菌中将含有重组PM 质粒的受体菌筛选出来的思路为
。
40．（2025·山东德州·二模）水稻是二倍体植物，其雄性不育性状由隐性基因控制。科研人员利用图中3
个目的基因和质粒构建重组质粒，并将其导入雄性不育水稻中，培育出仅一条染色体上含有目的基因的植
株M。植株M 自交能产生固定比例的雄性不育株。已知A 基因可以恢复雄性不育水稻产生花粉的能力，B
基因能阻断淀粉储藏使花粉失活，因而能有效阻止转基因花粉的传播。
(1)仅用一种限制酶切割会使A 基因以两种不同的方向插入质粒，但A 基因的表达产物相同，据图分析原
因是 。
(2)据图分析，将A、B 基因插入质粒时，应先插入 （填“A”或“B”）基因，理由是 。
通过农杆菌转化法将重组质粒导入雄性不育水稻的细胞，应选择添加 的培养基筛选出转化成功的
受体细胞。
(3)植株M 产生的花粉中不含目的基因，原因是植株M 形成花粉时，启动子b 在 （填
减
“
I”或
减
“
II”）末期启动了B 基因的表达。据此推测，植株M 自交，后代的表型及比例为 。
(4)已知启动子c 为胚乳细胞中特异性表达的基因的启动子，miRNA 基因产生的miRNA 可抑制淀粉酶基因
的表达，影响种子的透明度。为便于在种子时期即可筛选出雄性不育株，在培育植株M 时，科研人员将启
动子c 与miRNA 基因连接，并使之随A、B 基因一起导入水稻细胞。据此推测，引入启动子c 及miRNA
基因的作用分别是 。
41．（2025·内蒙古·二模）柿子的涩味程度与苯丙烷代谢关键酶基因（PAL）的表达情况有关。为筛选
PAL 基因调控蛋白，科研人员利用质粒B 和质粒H（如图）进行了相关研究。请分析回答下列问题：
(1)启动子区段除含有RNA 聚合酶识别位点外，还存在调控蛋白结合位点，两者通过影响 过程决
定基因的表达强度。
(2)由于PAL 基因启动子序列未知，为扩增PAL 基因启动子所在区段，需用限制酶切割基因组DNA 后，通
过 酶将已知序列信息的接头片段连接到PAL 基因启动子上游，随后根据接头片段和PAL 基因编码
区序列设计引物进行PCR。扩增时使用的耐高温DNA 聚合酶能催化脱氧核苷酸连接到引物的 端。
(3)利用质粒B 构建含PAL 启动子的重组质粒并导入亮氨酸缺陷型酵母菌，需用不含 的培养基筛选
成功转化的酵母菌Y2。将柿子的不同cDNA 片段分别插入质粒H 的位点 （填编号1~5），理由是
，从而获得重组质粒H1、H2……。
(4)将重组质粒H1、H2……分别导入酵母菌Y2，并将其分别接种到含 的培养基中培养。若Y2能生长，
则说明该cDNA 表达的蛋白与AD 蛋白结合形成了融合蛋白，并与PAL 启动子结合，激活 基因表
达，赋予酵母菌抗性。
42．（2025·北京东城·二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波
具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发
响应超声波的药物递送系统
细菌以
“
”
实现癌症的精准治疗。
(1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提
供 和维生素。可利用 的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治
疗。
(2)C 蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1 所
示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1 接受超声波刺激后，可升温至42℃， 从而发挥抗肿瘤作
用。
(3)T 蛋白有T1、T2 和T3 三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C 蛋
白表达量，结果如图2 所示。科研人员最终选择T3 基因进行后续研究，判断的依据是 。
(4)工程菌1 只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3 所示的基因表达载体的工程菌2，可
以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B 基因编码的B 酶可以作用于识别位点a 和b，
使a、b 处的DNA 发生断裂，最终导致a、b 之间的DNA 片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项
将表达载体补充完整。 ； ； ； ； 。
P1
①
启动子 ②P3 启动子（持续表达型启动子）
T3
③
基因 ④C 基因 ⑤B 基因
43．（2025·江西上饶·二模）反刍动物的瘤胃中含有分解纤维素的微生物，科研小组从瘤胃中分离培养分
解纤维素的微生物的流程如图1 所示。请回答下列问题：
(1)筛选、培养纤维素分解菌需要以纤维素为唯一的碳源，同时还需要 （答3 点）等营养物质，
从功能上分析，该培养基属于 培养基。
(2)科学家筛选出某微生物的W 基因可编码一种高效降解纤维素的酶，提取该微生物的基因组DNA，利用
PCR 技术将W 基因特异性扩增出来的关键是 ，扩增时复性的温度如果过高可能出现的结果是
，扩增出的W 基因需要利用电泳进行鉴定，鉴定的结果发现有多条条带，从引物设计或温度控制的角度分
析，可能的原因是 （答1 点）。
(3)如图3 所示，已知图中W 基因转录方向是从左向右，W 基因转录的模板链是 。结合图2 及
图3，解释KpnI 酶不可用的原因： 。
44．（2025·广东汕头·二模）野生型水稻（WT）的OsJRL 基因突变株具有更强的抗寒性。研究人员围绕
OsJRL 蛋白的分布、OsJRL 基因对水稻表型的影响及其作用机制等方面开展研究。回答下列问题：
(1)绿色荧光蛋白基因（gfp）表达的GFP 蛋白对细胞无毒性，且不会干扰细胞的代谢和功能。将OsJRL 基
因与gfp 基因连接在同一载体并导入水稻细胞，检测到水稻细胞 ，说明OsJRL 蛋白分布在细胞核
和细胞质。
(2)通过转基因技术培育OsJRL 基因敲除水稻植株（KO）和OsJRL 基因过表达植株（OE）。可通过替换
OsJRL 基因上游的 序列得到OE。若用PCR 检测两种实验材料是否构建成功，所设计的这对引物
需具备 的特点。三种水稻幼苗经5℃处理一段时间后，检测植株的存活率，结果见下表：
温度植株
存活率%
时间d
室温
5℃
WT
KO
OE
WT
KO
OE
5
100
100
100
98
100
98
10
100
100
100
68
75
43
15
100
100
100
25
68
14
实验结果说明 可以提高水稻的抗寒性。
(3)寒冷使细胞活性氧（ROS）增多，加速细胞衰老。检测发现，KO 植株具有最高的苯丙氨酸解氨酶
（PAL）活性和最多的类黄酮积累，ROS 水平最低。而OE 植株的ROS 最高，PAL 活性和类黄酮含量最低。
请在图的①~③选填
促进
或
抑制
，完善
“
”
“
”
OsJRL 基因调控水稻抗寒能力的机制。
① ；② ；③ 。
45．（2025·山东泰安·二模）土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56 导入不耐盐碱
水稻中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中Bar 为抗除草剂基因，Tetr
为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。
～
表示操作过程。
①
⑦
限制酶
BamH I
BclI
Sac I
识别位点及切割位点
（5’→3’）
-G↓GATCC-
-T↓GATCA-
-GAGCT↓C-
(1)过程
利用反转录
①
PCR 以 为模板扩增获得cDNA，过程
利用
②
cDNA 为模板扩增OsMYB56 基
因时使用的两种引物的序列为（从5’端向3’端方向写出前10 个碱基） 。
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti 质粒中CaMV35S 的功能是 。基因表达载体中，
OsMYB56 基因和bar 基因编码链的方向 （填
相同
或
相反
），其中
“
”
“
”
Bar 基因转录的模板链为
（填“a 链
或
”
“b 链
）。
”
(3)过程
应选用限制酶
③
切割质粒；过程
中筛选含有重组质粒的根瘤农杆菌时应先使用含
④
的培养基筛选，再使用含 的培养基；过程
应在含
⑤
的选择培养基上筛选；过程⑥
（填
需要
或
不需要
）给予光照；过程
若要检测
“
”
“
”
⑦
OsMYB56 基因是否转录，分子水平可采用的技
术有 。（答出一种即可）
46．（2025·江西赣州·二模）水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65 个氨基酸组成的单链多
肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其
抗凝血活性。请回答下列问题：
(1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a 是 ，物质b 是 。要对水蛭素的结构进行设计改造，
最终必须通过 来完成。
(2)若通过发酵工程利用大肠杆菌生产水蛭素，则一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ；若
通过乳腺生物反应器生产水蛭素，请写出简要操作步骤： 。
(3)利用 （填
大肠杆菌
或
乳腺生物反应器
）生产的水蛭素活性更高，原因是
“
”
“
”
。
47．（2025·江苏南京·二模）研究显示Gata3 基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点，Gata3 蛋白由444 个氨
基酸构成。为研究Gata3 蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3 基因融合，
构建基因表达载体转入小鼠受精卵，并整合到受精卵的染色体上，每个受精卵只导入一个目的基因，获得
能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。荧光蛋白成像系统显示两只小鼠均为Gata3-GFP 融合基因
阳性转入小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图所示，A、B、C、F、R 为不同引物，回答相
关问题：
(1)Gata3 基因编码区的碱基数量为 个。
(2)为了使GFP 基因能正确插入载体中，在利用PCR 扩增GFP 编码区序列的过程中，需要设计引物的F 和
R 分别为 。
5'-CCC
①
GTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC-3'
5'-CCC
②
GTCGACAAAAACACTTTTTGATATTCG-3
5'-CCC
③
CTCGAGTTCATGCTTGATATGCCAATC-3'
5'-CCC
④
GAATTCTTCTAGTCGACCACAAGAAG-3'
(3)在构建Gata3 基因与GFP 基因的融合基因时，应将 基因中编码终止密码子的序列删除，目的
是 。
(4)在GFP 基因的扩增及重组载体的构建过程中，使用的酶有 ，将酶处理过的目的基因和载体连
接时，需要在低温环境中操作，原因是 。
(5)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，将体细胞中都含有两个融合基因的雌
雄个体杂交，则F2中出现有荧光小鼠理论上约占 。
(6)为了确定目的基因插入到小鼠细胞中染色体上的具体位置，科研人员常用DNA 分子原位杂交技术，分
子杂交需使用特定序列的单链DNA（ss-DNA）作为分子探针。为制备大量单链DNA 片段，研究人员常采
用不对称PCR 技术。若反应体系中原有50 个模板DNA，最初10 个循环后限制性引物耗尽，再进行20 个
循环，理论上可制备ss-DNA （用科学计数法计数）个。
(7)研究人员从荧光小鼠中提取含融合基因的相关DNA 片段，若用引物A 和B 进行PCR 扩增，但没能扩增
出GFP 基因，从PCR 操作过程中温度控制角度分析，可能的原因有 （至少写2 点）。
(8)对荧光小鼠用荧光蛋白成像系统检测，相较于传统的物质提取、体外测量方式，引入荧光蛋白传感器测
量荧光蛋白的优点是 。
48．（2025·福建龙岩·二模）人肺特异性X 蛋白（LUNX）基因是某种肺癌诊断的标志物，增强子是基因
转录的调控序列，对启动子具有促进作用。为了研究LUNX 基因的增强子发挥作用的最佳位置是位于启动
子的上游还是下游，科研人员从人类全基因组序列数据库中筛选并扩增了3 个LUNX 基因增强子片段
（En，表示E1~E3），分别将每个En 片段定向连接到pGL3 载体中荧光素酶报告基因（luc+）启动子
（SV40 启动子）的上游或SV40 终止序列的下游，通过检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断。
luc+的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。相关信息见下图，回答下列问题。
(1)PCR 每次循环一般可以分为 三步。在上述实验的PCR 反应体系中共需要设计 种引物；
为了定向连接到pGL3 载体中，在引物5'端需要引入的限制性酶切位点有 种。
(2)将以上获得的En 经酶切后分别定向连接到用对应限制酶处理的pGL3 载体中，构建重组载体，利用相
关实验技术对荧光素酶活性进行检测，结果如图所示。
根据结果得出的结论是
①
。
据图判断，对
②
luc+表达促进作用最大的增强子的引物5'端需添加 限制酶的识别序列。
(3)半夏蛋白具有抗肿瘤等作用，科研人员提取半夏块根细胞中总RNA，纯化获得mRNA，后在逆转录酶
的作用下获得不同大小片段的半夏蛋白cDNA。构建高效表达半夏蛋白的重组质粒是利用基因工程实现大
规模生产半夏蛋白的核心工作，人员甲设想如下：根据实验室现有质粒A 的限制酶识别位点，在E1 增强
子引物的5'端添加相应的限制酶识别序列，以此为引物，进行PCR 扩增，得到足够数量的半夏蛋白
cDNA，再与质粒A 拼接，从而获得高效表达半夏蛋白的重组质粒，再进行后续实验。按此设想，甲进行
了PCR、电泳操作，结果无相应条带出现，判断是扩增失败了。经检查，PCR 所用的缓冲液、dNTP、Taq
酶均正常，PCR 操作程序正确，请分析扩增失败原因并提出改进措施：
失败原因：
①
。
改进措施：
②
。
49．（2025·河北张家口·二模）抗菌肽指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，抗
菌肽具有选择性免疫激活和调节功能，对败血症有良好的预防和保护作用。如图为培育转抗菌肽基因奶牛
的示意图。回答下列问题：
Xho I
5'-C↓TCGAG-3'
Sal I
5'-G↓TCGAC-3'
Mbo
I
5'-↓GATC-3'
Bam H
I
5'-G↓GATCC-3'
(1)据图可知，用限制酶 切割质粒，用DNA 连接酶连接质粒和被限制酶切割后的抗菌肽基因，目的
基因能正常转录，由图可知，转录的模板链为 （填“a 链
或
”
“b 链
）。
”
(2)图中
为
②
PCR 技术，PCR 反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+，其原因是 ，子链DNA 的延伸方向为
（用5'和3'表示）。
(3)去核卵母细胞去核的实质是去除 ，图中过程
可用物理或化学方法如
⑥
激活重构胚，使其完
成分裂和发育进程发育为早期胚胎。
50．（2025·山东日照·二模）研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白
T7RNAP 是一种噬菌体RNA 聚合酶(T7RNAP 的N 端或C 端单独存在时不能发挥作用，二者结合可形成完
整的T7RNAP)，nMag 和pMag 是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR 技术获
融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了
所需的工程菌。
(1)研究人员利用PCR 技术实现编码T7RNAPN 端的基因下游序列与编码nMag 的基因上游序列的无缝连接，
获得编码T7RNAPN 端-nMag 的融合基因，由图1 可知，引物2 的5＇端9 个碱基序列为5＇ 3
＇，如此设计引物2 的目的是 。用同样的方法获得编码pMag-T7RNAPC 端的融合基因。
(2)通用型启动子能够被纤维素生产菌的RNA 聚合酶识别，结构完整的T7RNAP 对T7 启动子表现出高度的
特异性。为获得蓝光诱导着色的纤维素生产工程菌，构建了下图所示的基因表达载体，图中3 个启动子中，
表示通用型启动子的是 (填序号)，表示T7 启动子的是 (填序号)。
(3)将构建好的载体导入纤维素生产菌前，通常用 处理受体细胞。为筛选出能够生产黑色纤维
素薄膜的工程菌，培养基中应添加 。
51．（2025·河北石家庄·二模）农业生产中大量使用有机磷农药导致水体遭到了严重的污染。研究人员将
源于施氏假单胞菌YC-YH1 的降解酶基因mpd 和ophc2 插入苦草（一种沉水植物）染色体中，让转基因植
物降解水体中的有机磷农药。下图是获得转基因苦草的基因工程操作程序，图1 所示基因mpd 和ophc2 与
引物结合位点及模板链分布情况。请回答下列问题：
(1)现需将基因mpd 和ophc2 通过PCR 技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据 设计特异性引物序
列，引物的作用是 。
(2)据图分析，将基因mpd 和ophc2 拼接成融合基因，基因mpd 的a 链的5 端与基因ophc2 的 （填
“a 链
或
”
“b 链
）的
”
3 端相连，理由是 。
(3)利用基因工程获得转基因植物的核心步骤为： ，据图2 分析，该过程需要选择限制酶 切
割融合基因。
(4)将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，卡那霉素的作用是 ，将筛选出的受体细
胞经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解有机磷农药，原因是 。
52．（2025·江西萍乡·二模）
中国辣都
萍乡，人人喜食辣椒，家家喜种辣椒。辣椒栽培过程中易受辣
“
”
椒疫霉菌侵染导致减产，某科研团队发现其体内的 CaSBP08 基因是一个能被辣椒疫霉菌利用的感病基因，
该团队欲通过 CRISPR/Cas9 技术实现对辣椒 CaSBP08 基因的特异性敲除，培育出抗疫霉辣椒。
CRISPR/Cas9 系统通过具有序列特异性的向导 RNA（sgRNA）引导 Cas9 蛋白靶向结合到目的基因的特
定区域，并对其进行切割。回答下列问题：
(1)Cas9 蛋白与基因工程中使用的 酶功能相似，二者的区别主要体现在 。
(2)该团队在 CaSBP08 基因中找到的靶序列为 5’ -ATGCCA……GTACCG-3’，则根据该靶序列设计的
sgRNA 序列应为：5’ - -3’。
(3)为保证 sgRNA 基因与下图中的 Ti 质粒准确连接，科研人员人工合成了 sgRNA 基因，sgRNA 基因两
条链碱基序列应该是 （填字母）。
A．5’ -GAATTCCCCGTAC… TGGCATGGTACC-3’
B．5’ -GGTACCCCGTAC……TGGCATGAATTC-3’
C． 5’ -GGTACCATGCCA…. GTACGGGAATTC-3’
D．5’ -GAATTCATGCCA…… GTACGGGGTACC-3’
Ti 质粒中用到了 U6、CMV 两个启动子，而不共用一个启动子的目的是 。
(4)该团队利用辣椒植株花序直接浸没在含有重组质粒的农杆菌溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子。
与农杆菌直接侵染植物叶片相比，该技术可以不需要经过 过程即可获得转基因植株。
(5)播种收获的种子，一段时间后，可以使用 筛选成功转化的辣椒植株，并通过
的方法对其进行个体水平鉴定。
53．（2025·甘肃白银·二模）L-乳酸和D-乳酸是同分异构体，前者作为一种食品酸味剂，被广泛应用于食
品加工中，后者却会导致人体中毒。为了去除廉价发酵原料中的D-乳酸，从而提高发酵最终产物L-乳酸
的光学纯度，研究者通过构建带有不同厌氧诱导启动子（pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB）的D-乳酸脱氢酶
基因（dld）的表达质粒（如图1 所示），并将其分别转入产L-乳酸的大肠杆菌HBUT-L，以期加强其在发
酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。回答下列问题：
(1)图1 中各质粒的启动子可在 条件诱导下被激活，从而发挥 的作用。相比于普通启动子
（无须诱导就有活性），使用诱导型启动子的优点是 。
(2)研究者构建的重组质粒pUC19-pflBp6-pnirB-dld 包含2 个启动子，其目的可能是 ；构建重组
质粒后，为了确定重组质粒是否构建成功，需进行PCR 检测。若每种重组质粒的PCR 检测仅使用一对引
物，则检测pUC19-pflBp6-dld、pUC19-pnirB-dld、pUC19-pflBp6-pnirB-dld 三种质粒应分别选择图1 中的引
物 。
(3)将重组质粒pUC19-pflBp6-dld、pUC19-pnirB-dld、pUC19-pflBp6-pnirB-dld 分别转化至出发菌株HBUT-L
中得到工程菌株HBUT-L2、HBUT-L3、HBUT-L4.转化成功后，在一定条件下检测各组D-乳酸脱氢酶活性，
结果如图2.该结果表明带有启动子pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB 的dld 基因表达质粒都能有效提高菌株的
D-乳酸脱氢酶活性，其中带 的dld 基因表达质粒的提升效果最好。
(4)根据（3）中结果，研究者拟对菌株HBUT-L4 的相关能力进行发酵验证，请简要写出验证思路：
。
54．（2025·安徽滁州·二模）γ-干扰素是水溶性二聚体细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤特性，并能调节免
疫系统的功能。研究人员成功利用毕赤酵母表达系统实现了猪γ-干扰素的高效表达。毕赤酵母基因组中含
有的AOXl 基因所携带的甲醇诱导型强启动子。回答下列问题。
(1)利用PCR 技术扩增猪γ-干扰素基因时，所使用的引物PL和引物PR是根据 设计的，还需要模板、
4 种脱氧核苷酸和 。综合图示分析，PCR 时相应的引物在猪γ-干扰素基因中结合位置正确是
。
A．
处：
①
PL、
处：
④
PR B．
处：
①
PR、
处：
④
PL
C．
处：
②
PL、
处：
③
PR D．
处：
②
PR、
处：
③
PL
(2)将重组质粒通过一定的技术手段导入组氨酸（组氨酸是毕赤酵母生长所必需的氨基酸）合成缺陷型毕赤
酵母菌株中，再置于不含组氨酸的毕赤酵母培养基中培养，以筛选出成功导入重组质粒的毕赤酵母，其原
理是 。
(3)将所选菌株置于液体培养基中连续培养若干天，需要每隔24 小时在培养基中加入甲醇，其目的是
，同时也为毕赤酵母提供能量。一段时间后，对培养基进行离心，然后收集上清液，再用抗原
抗体杂交
—
方法对上清液中的产物进行检测、鉴定。收集上清液的原因是 。
55．（2025·山西晋城·二模）花青素是一种水溶性色素，属于黄酮类化合物，具有多种养生功效。如图是
花青素合成酶基因（S）的cDNA（某种生物发育某个时期的mRNA 经逆转录产生的互补DNA）和Ti 质粒
图，科学家欲利用二者构建基因表达载体，培育出花青素含量更高的蓝莓。回答下列问题:
(1)利用PCR 技术扩增S 基因时，需要引物，引物是指 ，设计引物时引物的长度需要比计算出的
长度长一些，原因是 。PCR 扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，
出现该现象的原因可能有 （答两点）。
(2)根据图1 和图2 分析，上述基因表达载体的构建中应选择限制酶 切割S 基因的cDNA 和Ti 质粒，
其目的是 。图2 Ti 质粒中的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于 。
(3)研究发现普通蓝莓细胞原有的花青素合成酶基因（ANS）与S 基因存在同源区段，ANS 基因的同源区段
中除没有图3 所示的靶点序列（长度为15 bp）外，其余序列均与S 基因的同源区段相同，S 基因的同源区
段中只有一个靶点序列。为了筛选出花青素含量更高的蓝莓植株，科学家利用PCR 技术进行检测，在S 基
因靶点序列前方距离100 bp 长度选取一段序列合成上游引物A，靶点序列后方距离200 bp 长度选取一段序
列合成下游引物C，根据靶点序列合成上游引物B，如图3 所示。利用上述三种引物对培育的转基因蓝莓
和普通蓝莓的DNA 进行PCR 扩增及电泳分析，理论上讲，普通蓝莓的DNA 扩增产物电泳后会形成长度
为 bp 的条带，符合要求的转基因蓝莓的DNA 扩增产物电泳后会形成长度为 bp 的条带。
56．（2025·江西·二模）生物燃料乙醇是重要的清洁能源。酿酒酵母是用作乙醇发酵的重要菌种,但因其本
身跨膜转运木糖困难以及缺乏专一性的木糖代谢酶,故不能直接利用木糖进行乙醇发酵。我国研究人员对酿
酒酵母进行改造,研究出木糖专用酵母。为了提高乙醇的产量,研究人员利用基因工程技术将
基因与增强
启动子相连,导入受体细胞中,观察工程菌的乙醇发酵情况,技术路线如下图所示,其中①~④代表PCR 扩增引
物,
基因是亮氨酸合成基因,
基因是尿嘧啶合成基因。回答下列问题:
(1)酿酒酵母与果酒的制作密切相关,密闭瓶中的葡萄汁可发酵制作果酒,写出发酵过程的反应式
。葡萄酒制作完成后,对装有葡萄酒的瓶子的操作是 ,盖上一层纱布,控制温度条件,即可进行葡萄
醋的发酵。
(2)酵母细胞质膜上的转运蛋白从合成到定位,与该过程密切相关的细胞器有 ,对酵母
进行纯培养,配制的培养基通常采用 法灭菌。
(3)用于扩增
基因的引物是 (选填图中编号),为了使
基因与载体质粒有效连接,可以通过
PCR 技术在
基因的上下游引入限制性核酸内切酶 的识别序列,再用对应酶切后通过
DNA 连接酶连接。
(4)制备工程菌b 时,需要将重组质粒b 导入尿嘧啶缺陷型酿酒酵母中,用以木糖为唯一碳源和缺少尿嘧啶的
培养基进行筛选。据此,制备工程菌a 时,需要将重组质粒a+重组质粒b 导入
中,并用 的培养基进行筛选。
57．（2025·陕西汉中·二模）从正常人的血浆中提取的血清白蛋白（HSA）在临床上应用很广泛，有重要
的医用价值。下图是通过相关技术获取重组HSA 示意图，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K 呈
现蓝色。据图回答下列问题：
(1)若要体外获得大量的人血清白蛋白基因，采用PCR 技术扩增目的基因时，在PCR 反应体系中需加入引
物，引物的作用是 ，若目的基因扩增3 代，则共用引物 个。PCR 完成以后，常采用
法来鉴定PCR 的产物。
(2)过程
中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让
①
进入植物细胞；除尽农杆菌后，还须
转接到含 的培养基上筛选出转化的植物细胞。
(3)为检测HSA 基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，用 进行抗原
抗体杂交实验。
—
(4)科学家培养出一种转基因山羊，其膀胱上皮细胞可以合成人血清白蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中
将重组质粒通过 法导入山羊的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞的主要原因是 ，人
血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达的原因是 。
58．（2025·辽宁·二模）（GLP-1（胰高血糖素样肽-1））是一种治疗2 型糖尿病的药物，但是它在体内的
半衰期很短。利用融合PCR 技术通过将（GLP-1 基因与人的血清白蛋白（HSA）基因融合并通过大肠杆菌
表达，部分过程如下图所示，结果表明融合蛋白的半衰期显著延长，稳定性和疗效有所提高。请回答下列
问题：
(1)上述构建融合蛋白的技术属于 工程，其基础是了解GLP-1 和HSA 及其与 的
关系。
(2)融合PCR 技术能够实现GLP-1 基因和人的HSA 基因能正确融合的主要原因是 。
(3)若融合基因的L 链为转录的模板链，为保证融合基因和质粒正确连接，在设计引物 （填
“P1”“P2”“P3”“P4”）时应分别在引物的 （填“5'”或“3'”）端加上限制酶 的识别序列。在
PCR 中，引物的作用是 。
(4)已知β—半乳糖苷酶可分解无色的X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆
菌接种到含 的选择培养基上，表现为 色菌落的即为目的菌。
59．（2025·山东聊城·二模）大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以
增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，
然后与载体上绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因。成功 表达的Y-GFP 融合蛋白可用于Y
蛋白调控机理的研究。
(1)研究中首先要对Y 基因进行PCR 扩增。PCR 反应要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中一般需要加入
Mg²+,其原因是 。图甲所示Y 基因序列为转录的 （填
模板链
或
非
“
”
“
模板链
）。已知
”
EcoRI 识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI 识别序列为5'-GGATCC-3',这些限制酶识别序
列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y 基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 合蛋白，Y 基因下游扩增引
物应为5'- -3'（包括添加的限制酶识别序列，共写12 个碱基）。
(2)将初步构建的Y-GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行
抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP 融合蛋白。
(3)为探究Y 蛋白能否与S 基因（大豆类固醇化合物合成的关键基因）启动子序列结合，用S 基因启动子序
列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y 蛋白与DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产
生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白 （填
能
或
不能
）与
“
”
“
”
S 基因启动子序列结合，相比于a
条带， 条带放射性低的原因是 。
(4)过表达Y 基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y 蛋
白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。
60．（2025·宁夏银川·二模）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。
土壤中存在产PG 酶(增大蛋白质的溶解性)的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产PG 酶的方
案，流程如图1 所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2 所示。回答下列问题：
(1)过程
应用了
①
PCR 技术，利用PCR 技术扩增时，需要 种引物，引物的作用是
。一般还需要往PCR 反应缓冲液中加入Mg²⁺，其原因是 。PCR 反应过程可
在 PCR 扩增仪中自动完成，而后常用 来鉴定PCR 的产物。
(2)完成过程
需要先将
②
PG 酶基因与pPIC9K 质粒重组，据图分析，该过程中最好选择限制酶 切割。
(3)结合图中过程
分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是
③
。过程
中将重组质粒
④
酶切后，整合在酵母菌染色体上。
61．（2025·天津河北·二模）东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁
殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌
素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问
题。
(1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，
配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到
培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养，选择对霉菌抑菌率高的菌株进行后续操作。
(2)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。如图
是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。
利用
①
PCR 技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 ，PCR 过程中，经过4 轮循环，消耗引物
的个数是 。
若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的
②
5'端加入
（填“BamHI”或“NdeI”）的识别序列。
转化操作后提取受体细胞中的
③
DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如
下图。
电泳结果表明 。
62．（2025·吉林·二模）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs 转
移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题：
限制酶
识别序列
EcoR I
5'G↓AATTC 3'
BamH
I
5'G↓GATCC 3'
Sph I
5'CGTAC↓G 3
Sau3A
5'↓GATC3
Xma I
5'C↓CCGGG 3'
Asc 1
5'G↓GCGCGGG
3'
Mun I
5'C↓AATTG 3
(1)植物的生长发育的调控，是由基因表达调控、 和环境因素调节共同完成的。
(2)设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物 对CBFs 基因进行克隆，为了后续能将目的基因正
确连接到载体上，应在CBFs 基因上游引物的5′端添加 （“SphⅠ”或”Sau3A”或“MunⅠ”）识别序列。
(3)根据图示Ti 质粒的结构，应选用限制酶 切割Ti 质粒，并通过 酶进行连接，
连接后导入农杆菌，在培养基中添加 来筛选成功导入质粒的农杆菌。
(4)将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR
对CBFs 基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示，该转基因叶片的基因组中可能已整
合CBFs 基因。PCR 结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是
A．引物特异性不佳
B．复性温度太高
C．变性温度不够
(5)现已获取成功转入CBFs 基因的拟南芥植株，利用 技术对其进行检测，结果表明转入
CBFs 基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA。后续还应通过改变 ，以利于RNA 聚合
酶与之识别和结合，进而实现CBFs 基因在拟南芥中的转录。
63．（2025·四川达州·二模）茄子的花为两性花，其花和果皮因富含花青素而呈紫色，花青素的合成由两
对等位基因A/a、B/b 控制。为揭示茄子花青素合成的遗传机制，科研人员用纯合白花白果甲与纯合白花白
果乙杂交，结果如图。请据图回答下列问题：
(1)根据F2中紫花与白花的比例为 ，可初步判定等位基因A/a、B/b 位于 （填
一对
或
“
”
两对
）同源染色体上。
“
”
(2)由F2中紫果与白果的比例，可推测花青素的合成还与等位基因D/d 有关，基因d 不抑制花中花青素的合
成， （填
抑制
或
不抑制
）果皮中花青素的合成。由此假设可推知
“
”
“
”
F2的白花白果中纯合
子所占的比例应为 。
(3)为验证上述假设是否成立，科研团队进行了以下实验：
对图中的
①
F1进行测交，发现子代表现型及比例始终为 ，说明假设成立。
选取图中
②
F1植株和大量F2紫花白果植株，分别从2 号、3 号和6 号染色体提取到A/a、B/b、D/d 基因并
进行凝胶电泳，出现如图所示的五类结果。
该电泳结果 （填
支持
或
不支持
）上述假设，其中基因
“
”
“
”
（选填电泳图谱中的数字
1～6）代表基因d。
64．（2025·山西吕梁·二模）大豆是我国重要的油料作物和植物蛋白的主要来源，但盐胁迫会严重影响大
豆植株的生长。研究人员欲将酵母菌细胞中的耐盐基因ENA1 导入大豆体内以提高其耐盐性，如图为构建
的基因表达载体的部分结构。回答下列问题：
(1)利用PCR 方法从酵母菌基因组中扩增ENA1 基因时需根据 设计引物，PCR 反应体系中除加入
ENA1 基因、4 种脱氧核苷酸等物质外，还需加入 酶。
(2)为了检测目的基因是否正向插入，可选用图中的引物 对其进行扩增，并对扩增产物进行电泳，若
结果为 （填
获得扩增产物
或
未获得扩增产物
“
”
“
"），则说明ENAI 基因正向插入。
(3)将目的基因导入植物细胞常采用的方法为 ，得到转基因大豆植株后，研究人员对转基因大豆T2～
T4代进行了PCR 及电泳，实验结果如下图所示（1kb=1000bp）：
图中1 组为标准对照组，2 组为加水对照组，3 组为加入野生型大豆DNA 的PCR 产物组，则4~7 组为加入
组，已知ENA1 基因扩增条带大小为550bp，Bar 基因扩增条带大小为441bp，则图 表示扩增的基因
为ENA1，连续三代PCR 检测结果说明 。
(4)Bar 基因为抗草甘膦基因，大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草，推测该实验在转入ENA1 基因的同
时还转入Bar 基因，目的是排除 。从分子水平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达，可采
用 方法。
65．（2025·四川达州·二模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30 蛋白基因
（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1 为质粒
构建、疫苗生产以及效果测试示意图。请回答下列问题：
(1)完成图1 的过程
需要向反应体系中加入
②
酶。利用PCR 技术扩增p30-CRM197A 融合基因时，
需要向反应体系中添加的引物是 （选填图中的F1~F4）。
(2)选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用 处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中
DNA 分子的生理状态。图1 中培养导入重组质粒的大肠杆菌时，采用的接种方法是 。
(3)筛选时，科研人员挑选了5 个菌落，提取质粒后加入BamHI、HindⅢ酶切、电泳，结果如图2：
可初步判断
①
号菌落的质粒中含有p30-CRM197A 融合基因。
p30
②
基因和CRM197A 基因 （填
含
或
不含
）
“
”
“
”
BamHI 和HindⅢ酶切位点，理由是
。
(4)科研人员在检测上述菌落时发现某个菌落同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，出现此现象的可能原
因有：
有些大肠杆菌同时导入了空载质粒和融合基因表达质粒：
①
导入空载质粒的大肠杆菌和导入触合基因表达质粒的大肠杆菌在接种时未分散开，导致
②
。
(5)为检测融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30 蛋白、p30-CRM197A 融合蛋白分别注入小鼠体内，一段
时间后检测抗体含量，结果如图3 所示。据此可判定融合蛋白疫苗效果更好，依据是 。
66．（2025·黑龙江哈尔滨·二模）在2024 年国际基因工程大赛全球总决赛中，中国农业大学代表队实现了
在根瘤菌中生产高附加值的ω--3 多不饱和脂肪酸 DHA 并因此荣获金牌，为全球可持续发展提供了新思路。
已知 FADSI 基因是控制ω--3 多不饱和脂肪酸 DHA 合成的关键基因。下图1 为质粒（大小3000bp）和
FADSI（大小300bp）示意图, Tet'表示四环素抗性基因, Amp'表示氨苄青霉素抗性基因, BamHⅠ、 BclⅠ、
NotⅠ、Sau3AⅠ表示不同的限制酶，四种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示（对应箭头指向位置为相
应限制酶的切割位点，不考虑其他未知的酶切位点）。请回答下列问题：
限制酶
BamH Ⅰ
Bcl Ⅰ
Sau3A Ⅰ
NotⅠ
识别序列及切割位
点
(1)为了获取更多 FADSI 基因，可利用 PCR 技术对其进行扩增。为保证扩增效率，至少需加入 种
引物。
(2)构建重组质粒时，技术人员仅使用了Sau3AⅠ一种限制酶以及 酶即实现了 FADSI 基因与质粒的
重新连接，原因是 。
(3)若 BamHⅠ酶切的 DNA 末端与 BclⅠ酶切的 DNA 末端连接起来,其连接部位的6 个碱基对序列为
。
(4)为存储含 FADSI 基因的重组质粒，导入大肠杆菌，采用含有
氨苄青霉素
的培养基进行筛选，得到
“
”
A、B 两类菌落，则这两类菌落的质粒导入情况是 。研究者从两菌落中挑选出菌落1 和2，提
取质粒进行PCR 扩增，利用Sau3AⅠ酶切后经电泳的结果如图2。推测图2 中，菌株 可能就是
目的菌株，理由 。
(5)相对于动植物，利用根瘤菌生产ω--3 多不饱和脂肪酸 DHA 的优点 。（至少答出两点）
67．（2025·河南·二模）科研人员根据获得的红花转录因子基因（CtWRI1）的cDNA 序列设计引物，通过
PCR 获得CtWRI1 编码序列，并通过烟草遗传转化对其功能进行研究。图甲为实验过程中使用的Ti 质粒图
谱及T-DNA 结构，其中Rifr代表利福平抗性基因，bar 代表除草剂抗性基因，LB 和RB 分别代表T-DNA 的
左边界和右边界。图乙为不同限制酶的酶切序列和CtWRI1 的结构及转录方向。
回答下列问题：
(1)为了将CtWRI1 编码序列与图甲中的Ti 质粒正确连接，构建引物F 和引物R 时应在 端分别添加
的识别序列，通过酶切和连接后可获得连接产物。
(2)CtWRIl 转录的模板链的序列为：5'-TTAGCCT……TACCGACAT-3'，请写出引物R 的前10 位碱基序列：：
5'- -3'。
(3)通过 法将CtWRII 编码序列导入烟草细胞，利用含 的培养基对烟草细胞进行初步筛选，
再通过 技术获得转基因烟草。可以通过 等技术从分子水平上检测烟草细胞的染色体DNA
上是否插入了CtWRI1 编码序列。
(4)科研人员测定野生型烟草（WT）和转基因烟草中CtWRI1 的相对表达量、脂肪酸合成基因的相对表达
量和种子含油量，结果见图丙。据图丙分析，转基因烟草种子含油量增加的可能原因是 。
68．（2025·重庆·二模）隐花色素CRY 是植物的蓝光受体。研究发现，其在蓝光作用下可与赤霉素信号转
导通路中的关键蛋白GAI 结合并提高其稳定性。为探究CRY 蛋白的哪个部位可以与GAI 蛋白发生相互作
用，研究者分别构建了含CRY 基因不同片段和GAI 基因的表达载体。翻译过程中，肽链的合成方向是氨
基端
羧基端
→
(如图1)，GAI 基因与载体结构信息如图2。
(1)PCR 的每次循环一般可分为三步，其中理论温度最低一步的主要目的是 。
(2)研究发现，赤霉素通过对GAI 蛋白的降解，来实现下游的信号调控，据此分析，蓝光照射下植物的株高
将 (填
变高
或
变矮
“
”
“
”)。
(3)为使表达出的GAI 蛋白的氨基端带有一段标签短肽GST，在通过PCR 技术扩增GAI 基因时可采取的措
施是 ，将所得修饰后的GAI 基因和质粒构建基因表达载体(质粒1)导入大肠杆菌后，在含卡那
霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带GAI 基因，将引物R₀、F₀、R₁、F₁ 共同加入
反应体系后，分别以抗性菌落的DNA 为模板进行PCR 扩增后并电泳。理论上携带重组质粒的PCR 产物电
泳结果应出现的条带数目为 。若要确定GAI 基因是否正确连入质粒，则可选用引物
进行PCR 扩增，并电泳检验是否存在产物。
(4)分别扩增CRY 蛋白的氨基端与羧基端基因，并利用上述的方法使其带有短肽标签His，获得重组质粒2
和质粒3。将质粒1、2 和3 分别导入细胞，裂解细胞收集到三种蛋白，将不同蛋白分别通过带有His 抗体
的介质，洗脱丢弃未结合蛋白，利用抗原
抗体杂交的方法向介质中加入带荧光标记的抗
—
抗体，
洗脱未结合抗体。若荧光检测结果如图3，则可确定与CRY 蛋白可与GAI 结合的区域是 。
69．（2025·四川广安·二模）干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因
技术将大肠杆菌的耐旱基因（mtlD）整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。
限制
酶
识别序列及切割位点
（5'→3'）
BamHI
G↓GATCC
BclI
T↓GATCA
SmaI
CCC↓GGG
(1)可采用PCR 技术扩增目的基因，PCR 扩增的原理是 。在反应体系中除加入模板、dNTP、含
Mg2+的缓冲液外，还需要加入 。
(2)为了保证mtlD 基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD 基因的引物时，应在两种引物的
5'端分别添加 限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物5'- -3'（含12 个碱基序列）。
酶切后的目的基因片段和质粒通过 （填“EcoliDNA 连接酶
、
”
“T4DNA 连接酶
或
”
“E-coliDNA
连接酶或T4DNA 连接酶
）进行连接。
”
(3)为检测mtlD 基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI 和 进行双酶切，
通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现 个条带，则说明插入成功。
(4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法 。
70．（2025·河南·二模）生长激素制剂是治疗垂体性侏儒症的特效药。人们从450 升大肠杆菌培养液中提
取的生长激素，相当于6 万头动物的全部产量。图1 是通过基因工程将人的生长激素基因导入大肠杆菌中
生产生长激素的过程，图2 是基因工程中所用到的质粒，图3 是通过PCR 获取和扩增目的基因。请回答下
列问题：
(1)图1 通过 过程得到目的基因A 后，通过
过程进行
③
PCR 扩增。图1 中基因工程的核心步骤是
（填序号）。
(2)若利用图3 过程获取和扩增A 基因，需要选择的一对引物是 。图3 中的基因表达时，
（填“a”或“b”）链作为转录的模板链。
(3)要使A 基因能正确与图2 中的质粒拼接在一起，需要在所选引物的 端分别增加相应的限制酶
的酶切位点。分析图2 和图3，为了防止目的基因的反向连接，可在目的基因的上、下游分别添加
（填限制酶名称）的识别序列。
(4)科学家将A 基因与乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，导入性染色体组成为 的哺乳动物受
精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物，若该动物 ，
则转基因动物培育成功。
71．（2025·黑龙江齐齐哈尔·二模）番茄不耐寒，低温易冻伤，难以储藏。我国科研人员从某种耐寒植物
中提取了抗冻基因AtCOR15a，经过转基因技术获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。回答下列
问题：
(1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有 （填序号）。
操作方法简便
目的性强，能定向改造生物性状
育种周期短
①
②
③
不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍
安全性高，对生态没有威胁
④
⑤
(2)获得图中
的过程称为
①
，该过程使用的限制酶是 原因是：
。
(3)将
与用
①
处理的农杆菌混合，从而将目的基因导入农杆菌，最终整合到宿主胞的
上，该方法称为 。
(4)如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，过程称为反向
PCR，具体流程如下图（以EcoRI 酶切为例）
若下表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，选用的PCR 引物序列必须是 引物①②③④
中选择，填编号）。
DNA 序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序
列
5'-AACTATGCGCTCATGA-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
3'-TTGATACGCGAGTACT-CGITACGCAICGGAGA-5'
5' -AACTATGCGCTCATGA-3'
①
5'
②
-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
PCR 引
物
5' -AGAGGCTACGCATTGC-3'
③
5'
④
-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(5)为了提高AtCOR15a 基因在受体细胞的表达水平，可将AtCOR15a 基因与外源强启动子连如下图所示。
利用PCR 检测上述连接是否成功，可选择的引物组合是 （填序号组合）。（注：图中
、
①
②、
、
表示引物）
③
④
72．（2025·河南郑州·二模）棉花是重要的经济作物，但其生长易受杂草和棉铃虫的侵害，从而造成减产。
科学家成功构建了抗除草剂和抗虫双价植物表达载体pBI121-Bar/Bt（pBI121 是Ti 质粒，Bar 是抗除草剂基
因，Bt 是抗虫基因），构建过程如下图所示，并通过农杆菌转化法获得了具有两种抗性的转基因棉花。请
回答相关问题。
(1)Ti 质粒pBI121 中的35S 序列属于 （填
启动子
或
终止子
），它的作用是
“
”
“
”
。据图
分析，Bar 基因插入MCS 序列后，以 （填“α”或“β”）链为模板进行转录。
(2)请仿照图例在下图合适位置中标出MCS 序列被酶切后产生的切口，以保证能成功构建重组质粒pBI121-
Bar 。
(3)检测pBI121-Bar 是否重组成功，通常要用到大肠杆菌，经Ca2+诱导后使其处于能 的状态，筛选
时需向培养基中额外添加 （填物质名称），然后挑选平板上生长的单菌落，利用Bar 基因两端序列
制作的引物进行PCR，并采用 来鉴定PCR 的产物。
(4)pBI121-Bar 与Bt-4AB 成功重组后，需导入农杆菌LBA4404 中，该农杆菌含Vir 基因，酚类物质可以诱
导其表达。Vir 基因表达的产物能识别Ti 质粒的LB/RB 序列，水解 （填化学键）将T-DNA 剪切
下来。
(5)农杆菌与棉花愈伤组织共培养时，T-DNA 发生转移并整合到 。个体水平上检测时，可通过
来确定棉花是否具有抗性及抗性程度。
73．（2025·安徽合肥·二模）青岛假单胞菌P 中存在的单加氧酶（alkB）基因是有效降解石油烃的关键酶
基因。科研人员利用该基因按照如图1 所示流程获得了优质大肠杆菌工程菌，进行石油污染物降解。回答
下列问题。
(1)科研人员常从 的环境中获取青岛假单胞菌P。
(2)科研人员设计了一个PCR 体系进行alkB 基因的扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳技术分析，结果如图2
所示。
为了便于
①
alkB 基因与pET-28 载体有效拼接，PCR 扩增时需要在alkB 基因X、Y 两侧分别添加BamHI 和
HindⅢ酶切位点。BamHI 和HindⅢ酶的识别序列及alkB 基因的部分序列如图2 所示。写出结合在Y 侧的
引物的序列5' 3'。
研究人员初步判断该
②
PCR 体系成功扩增出了alkB 基因，据图2 分析，判断的依据是 。
(3)在摇床培养大肠杆菌时，需添加一些诱导物，诱导alkB 基因表达，同时，还需要加入卡那霉素，添加
卡那霉素的作用是 。
(4)经LB 培养基活化诱导后，科研人员取菌液4mL 接种到100mL 的原油培养基中，设置阴性对照组，检
测工程菌的降解能力，结果如图3 所示。
阴性对照组应向原油培养液中加入
①
。
根据实验结果，得到的实验结论为
②
。
74．（2025·安徽安庆·二模）随着全球工业化的推进，环境雌激素来源于各种农药及其代谢物、防晒剂等，
并通过污水排放和地表水径流进入水体环境，进入人体内的环境雌激素对人类健康产生了极大的危害。在
环境雌激素的诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原的水平与环境雌激素的浓度呈正相关。若向斑马鱼体内转入
荧光蛋白基因，在特定条件下能发出荧光。科研人员欲利用基因工程技术，构建能够监测环境中雌激素污
染物的转基因荧光斑马鱼，实验部分流程如图1 所示。图2 所示pEGFP-1 是一种无启动子的绿色荧光蛋白
（EGFP）载体，其中KanR 为卡那霉素抗性基因，ori 为复制起点，poly（A）为终止子序列，BamHⅠ、
HindⅢ、StuⅠ、KasⅠ所指位置分别是4 种限制酶的切割位点。回答下列问题：
(1)基因工程的核心环节是 。已知卵黄蛋白原启动子序列中无上述四种酶的识别序列，扩增时应在
引物的 端添加相应的碱基序列，不在另一端进行操作的原因是 。
(2)依据pEGFP-1 的结构，应选择 两种酶对质粒进行切割，再利用DNA 连接酶将其与卵黄蛋白原
启动子序列缝合。不选用另外两种酶切割的理由是 （答出两点）。
(3)对重组质粒进行检测和鉴定后，通过 法导入斑马鱼的胚胎中，并从个体水平检测转基因斑马鱼
是否表现出绿色荧光。为避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，可考虑采取的措施是 （答1
点）。
75．（2025·北京海淀·二模）大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的受体细胞。研究者利用大肠杆菌开展转
录起始和调控机制的研究。
(1)作为基因工程载体的质粒上一般含有启动子、 （至少填2 个）等序列，其中启动子是RNA 聚合酶
识别和结合的部位。
(2)研究者利用大肠杆菌质粒进行体外单轮转录实验：用限制酶切割质粒，获得包含启动子序列的DNA 模
板，与足量RNA 聚合酶混合并保温，使RNA 聚合酶充分结合至启动子；依次加入足量的肝素（能与游离
的RNA 聚合酶结合，使其不能再结合启动子）和放射性标记的4 种核糖核苷酸，一段时间后电泳检测转
录产物，结果如图1。
电泳结果显示，除了正常长度的
①
RNA 外，转录还会产生 ，研究者称其为
无效转录物
。
“
”
对
无效转录物
的产生机制有两种假说：
②
“
”
a．一个RNA 聚合酶与启动子结合后，先反复转录出多个无效转录物，然后该聚合酶在DNA 上延伸并只
转录出一个正常长度的RNA，最后从DNA 上脱离。
b．一个RNA 聚合酶与启动子结合后，仅转录出一个RNA，该聚合酶就从DNA 上脱离；转录出的RNA
多数为无效转录物，少数为正常长度的RNA。
单轮转录实验中，若DNA 模板的数目（m）、无效转录物的数目（p）、正常长度RNA 的数目（q）之间
存在数量关系 （用m、p、q 表示），则支持假说a。
(3)阻遏蛋白R 能与启动子附近下游序列结合，抑制转录。设计实验探究R 的作用是抑制RNA 聚合酶与启
动子的结合，还是抑制RNA 聚合酶在DNA 上的延伸。
其中实验组的步骤如下。请将正确的试剂对应的字母填入横线上。
①
DNA 模板与足量 混合并保温，再加入足量 混合并保温；依次加入足量的 和
反应一段时间，然后加入 再反应一段时间，电泳检测转录产物。
a．IPTG（使R 脱离且不再与DNA 结合）
b．肝素
c．RNA 聚合酶
d．放射性标记的4 种核糖核苷酸
e．阻遏蛋白R
电泳结果如图
②
2，表明R 。
四、实验题
76．（2025·北京东城·二模）我国科研人员培育出复粒水稻（CL），与普通单粒水稻（NCL）相比，具有
多粒簇生的特点。
(1)油菜素内酯（BR）是一种植物激素，是参与调节水稻籽粒生长发育的有机物，作用具有 的特
点。
(2)如图1 所示，幼穗中分生组织将发育形成不同部位。研究人员检测了CL 和NCL 幼穗不同部位中BRD3
（BR 降解酶）的表达量。结果显示：与NCL 相比，CL 中 。
(3)研究人员利用图2 质粒转录得到两种RNA 探针，通过RNA 杂交技术检测幼穗组织相关基因转录情况，
具体步骤如下表，请将实验材料补充完整（填选项）。
步骤
实验组（探针序列与
BRD3 的mRNA 互补）
对照组（探针序列与
BRD3 的mRNA 相同）
使用限制酶将图2 质粒切成线
形
①
②
使用RNA 聚合酶转录得到
RNA，制备带标记的探针
③
④
取NCL 和CL 幼穗的组织，制作成临时装片
将探针加入处理好的装片中，结合探针的部位会产生显色反应
a.Nco I b.Sal I c.T7RNA 聚合酶 d.SP6RNA 聚合酶
观察2 种水稻幼穗组织显色情况，在答题卡的图中标出预期结果。 。
(4)蛋白GSK 和MADS 均为BR 信号通路中的调控因子，在体外进行实验的处理和结果如图3，结果说明
。经过一系列的研究，科研人员阐明了水稻通过BR-GSK-MADS 通路调控复粒性状。
(5)已有研究表明，BR 缺陷水稻的籽粒通常会变小。请从基因选择性表达的角度解释“CL 同时具有多粒簇
生和籽粒不变小特点
的原因。
”
。
77．（2025·广东清远·二模）茶树具有重要的经济价值，春季茶芽的萌发情况与其产量和品质密切相关。
脱落酸ABA 通过整合环境和代谢信号，精准控制休眠的诱导与解除时机。研究表明茶树EXP 基因上游启
动子区存在脱落酸相关响应元件，PIF7 基因在植物的萌发中也具有重要作用，研究人员就茶树中的EXP
基因和PIF7 基因参与萌发的分子机制进行了研究。回答下列问题：
(1)提取茶树总RNA，通过 过程，获取PIF7 基因，作为克隆PIF7 基因的模板。以下是EXP 启动
子部分序列和设计的一些引物，扩增出EXP 启动子序列需选择下列引物 （填序号）。
5'-CGAATCTCGGCCACCACTC……GTTGCACCGATAGATGGCC-3'
3'-GCTTAGAGCCGGTGGTGAG……CAACGTGGCTATCTACCGG-5'
5'-CGAATCTCGGCCACCACTC-3'
①
5'-GTTGCACCGATAGATGGCC-3'
②
5'-GAGTGGTGGCCGAGATTCG-3'
③
5'-GGCCATCTATCGGTGCAAC-3'
④
(2)研究人员以某茶树品种为实验材料，采集不同部位，检测PIF7 和EXP 基因的相对表达量（图1），结
果表明 ；使用100μmol/LABA 喷施处理叶片，检测不同处理时间叶片中PIF7 和EXP 基因的相对表
达量（图2），表明 。
(3)为了进一步探究基因PIF7 和EXP 的作用关系，构建了相关的基因表达载体1 和载体2（图3），导入到
模式植物烟草叶片中，并检测荧光强度（图4），已知PIF7 基因的表达产物PIF7 蛋白在细胞核内作用，
结合图3 和图4 推测PIF7 蛋白和EXP 启动子的关系可能是 。
注：空载体指不含PIF7 基因的载体1
(4)结合题干和上述研究结果，推测基因PIF7 和EXP 参与茶树萌发可能的分子机制： 。
78．（2025·山东德州·二模）小鼠毛色的黑色、灰色、白色与多对基因有关，从一个黑色显性纯合的野生
型小鼠品系中选育出6 个不同的单基因隐性突变纯合品系
～
。品系
与野生型小鼠杂交，
①
⑥
①
F1均为黑色，
F1自由交配，F2雌雄个体的表型均为黑色:白色=3:1。科研人员又进行了如表所示的杂交实验。
组别
亲本
F1表型
F1自由交配得F2表型及比例
I
①♀
②♂
白色
白色
II
①♀
③♂
黑色
黑色:白色=1:1
III
①♀
④♂
黑色
黑色:白色=1:1
IV
①♀
⑤♂
黑色
黑色:灰色:白色=9:3:4
V
①♀
⑥♂
黑色
黑色:灰色:白色=9:3:4
VI
⑤♀
⑥♂
黑色
黑色:灰色=9:7
(1)①、
品系的出现体现了基因突变具有
③
性。第II 组F2表型及比例为黑色:白色=1:1 的原因是
。若品系
和
杂交，
③
④
F2表型及比例为 。
(2)由表中结果推测，控制小鼠毛色的基因至少为 对，这些基因至少位于 对同源染色体上。
(3)若品系
和
的突变基因分别为
⑤
⑥
e 和f，根据IV、V、VI 组实验结果，对两种基因是位于常染色体、X
染色体，还是位于X、Y 染色体同源区段上可做出 种合理的假设。为了探究哪种假设成立，提取
VI 组
及
⑤⑥
F2中所有雄性个体（包括理论上所有类型）体细胞中的相关基因进行PCR 扩增，将产物经酶
切后进行电泳，结果如图1 所示。已知条带1 和条带2 分别表示E、F 基因，推测f 基因应是F 基因发生碱
基对的 形成的，进一步推断e 和f 基因所在的染色体分别是 。
(4)为进一步确定
品系的突变基因在某染色体上的具体位置，对来源于该染色体的
⑤
5 个DNA 片段
（A~E）进行分子标记检测，结果如图2 所示。据图分析，6 个分子标记在该染色体上的排序为 。
仅有片段A 和C 检测到突变基因，据此判断突变基因应位于分子标记 （填数字编号）之间。
79．（2025·广东深圳·二模）噬菌体表面展示技术是一种基因工程技术，通过将外源基因插入噬菌体外壳
蛋白基因中，使外源蛋白以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，这种技术可用于筛选高亲和力抗体。丝状噬
菌体呈细长管状，由衣壳蛋白和DNA 组成，衣壳蛋白中有一类衣壳蛋白III（PIII）与噬菌体感染有关。回
答下列问题：
(1)研究人员将EcoRI 基因和PIII基因融合进行表面展示，过程如图。首先将EcoRI 基因插入PIII基因中；再
将重组噬菌体DNA 成功导入 进行培养，获得子代重组噬菌体；为检测EcoRI 蛋白是否成
功展示在重组噬菌体表面，可采用 对重组噬菌体进行检测。
(2)根据噬菌体表面展示技术的目的，推测展示在噬菌体表面的EcoRI 蛋白 （填
会
或
不
“
”
“
会
）影响重组噬菌体的感染过程。为证明该推测，研究人员设计如下表实验并检测感染能力。根据以上
”
信息，完成下列表格。
对照组
1
对照组
2
对照组
3
实验
组
野生型噬菌体
-
+
+
-
重组噬菌体
+
-
-
+
过量游离的EcoRI 蛋
白
+
-
+
-
的抗体
+
+
+
+
感染能力
强
强
弱
注：“-”表示未添加，“+”表示添加
(3)抗体的结构包含VH和VL。研究人员从抗原phOx 免疫的小鼠脾脏中提取mRNA，经 过程获得
VH和VL的cDNA。将一系列VH和VL的cDNA 随机两两组合后，插入PIII基因，构建出2×105种噬菌体克隆
作为文库。从文库中选择568 种噬菌体进行检测后发现，能与抗原phOx 结合的噬菌体极少，若实验操作
没有问题，则表明该噬菌体文库中 。
(4)研究人员将抗原phOx 附着在特定基质上，将噬菌体文库中的噬菌体通过基质，并进行多次重复，每次
重复时减少基质上抗原phOx 的密度，推测多次重复的意义 。
80．（2025·山东菏泽·二模）抗菌肽以其快速杀菌活性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前
景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52 位的脯氨酸（密码子为CCC）替换成苏氨酸（密码子为ACG）可
增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR 定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。
请回答下列问题：
(1)若将抗菌肽第52 位的脯氨酸换成苏氨酸，则基因转录模板链对应碱基的变化是 ，据图分析，写
出第51 位氨基酸对应的密码子是 。
(2)据图分析，
大引物
“
PCR 定点诱变
技术中设计的
诱变引物
应选择
”
“
”
________。
A．5'…ATAGCAGGC…3'
B．5'…ATAACGGGC…3'
C．5'…GCCTGCTAT…3'
D．5'GCCCGTTAT3'
(3)进行大引物PCR 定点诱变获得改良的抗菌肽基因，需要进行两次PCR（PCR1 和PCR2），产物1 最早
出现在PCR1 的第 轮循环；PCR2 的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；若考虑1 个改良的
抗菌肽基因通过PCR3 快速扩增，则第n 次循环共需引物 个。
(4)PCR 过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是 。在
PCR 扩增改良的抗菌肽基因时，研究人员尝试利用降落PCR 技术提高扩增特异性。降落PCR 的原理是：
在PCR 前几个循环先设置较高的复性温度，随后每个循环均降低一定温度，直至达到适宜复性温度。结合
PCR 原理分析，降落PCR 能提高特异性的原因是 。
81．（2025·甘肃白银·二模）CRISPR/Cas9 基因编辑技术可用于基因敲除，其主要包含两种成分——Cas9
蛋白及小向导RNA（sgRNA），其作用原理如图1 所示。某科研团队利用该技术对拟南芥的Sv14 与Sv15
基因进行敲除，探究Sv14、Sv15 基因对拟南芥花粉育性的影响。请回答下列有关问题：
(1)将Cas9 蛋白及sgRNA 导入拟南芥细胞，我国科学家独创的一种方法是 。据图1 分析可知，Cas9
蛋白的功能相当于 酶。
(2)①为了提高敲除拟南芥的Sv14、Sv15 基因的成功率，一般先敲除其中一个基因获得单突变体，在此基
础上继续敲除另一个基因获得双突变体。已知拟南芥的Sv14、Sv15 基因模板链碱基序列如图2 所示。
请根据Sv14、Sv15 基因模板链碱基序列设计敲除Sv14、Sv15 基因过程中所用到起向导作用的sgRNA（若
sgRNA 为10bp，且选取模板链NGG 之前的序列设计，“N”表示任意核苷酸）。
Sv14—sgRNA：5′— —3'。
Sv15—sgRNA：5′— —3'。
为验证是否完全敲除，可提取待测拟南芥的总
②
DNA，加入 种引物进行PCR 扩增，PCR 产物长度
常采用 技术鉴定，理论上出现 种条带说明成功获得双突变体。
(3)对于成功转化的拟南芥植株还需进一步进行表型鉴定，研究人员选取不同转基因拟南芥采集花粉，观察
并计算花粉萌发率，结果见下表。
组别
野生
型
Sv14 突变
体
Sv15 突变
体
Sv14、Sv15 双突变
体
花粉萌发
率
95.0%
39.8%
80.0%
30.0%
根据以上表格，可得出的结论是 。为进一步验证这一结论，请用基因工程手段以Sv14、Sv15 双突
变体为材料设计实验并预测结果： （基因工程具体操作不做要求）。
82．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1 产生
的LA1 酶可耐高温，菌株2 产生的LA2 酶具有高催化效率，且LA1 基因和LA2 基因具有93%的同源性。
研究人员采用交错延伸PCR 技术获得了重组LA 基因，生产出了更高效的酶。
(1)交错延伸PCR 技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2 均做
模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程
起始引物片段均为
①
25 个
核苷酸，TaqDNA 聚合酶延伸速度为1200 个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s，复性15s，延
伸15s，经过80 轮交错循环后，可获得PCR 混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷
酸。
(2)获得的重组LA 基因中，同时具有LA1 和LA2 基因序列的原因是 。
(3)过程
用到的
②
PM 质粒中A 为启动子、B 为氯霉素抗性基因cat、C 为终止子、D 为asd-突变基因、E 为
复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd 基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP 合成途径的关键
酶，asd 基因缺失时，将导致菌株生长对DAP 依赖。为使目的基因定向插入PM 质粒，交错延伸PCR 过程
中引物的5′端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程
中应采用
③
asd 基因
的受体菌。从含有PM 质粒、重组PM 质粒的受体菌中将含有重组PM 质粒的受体菌筛选出来的思路为
。
83．（2025·天津·二模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠
杆菌体内导入含特殊DNA 序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方法。
回答下列问题：
(1)Pc 和Ps 启动子可被 酶识别并结合后,驱动沿基因的模板链 方向转录出mRNA。与
mRNA 相比，启动子特有的物质组成是 。分析图1 可知，当环境中存在水杨酸时，
可激活PS 启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。
(2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1 替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸
条件下 ，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。
(3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp 基因
连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR 判定融合基因已准确连
接，应选择图2 中的引物组合是 。
(4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将
ccdA、ccdВ 两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动
自毁
。已知
“
”
ccdВ 基因表达毒蛋
白可使工程菌致死，ccdA 基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdВ 分别插入图3 中的
、 位点。
84．（2025·云南曲靖·二模）CRISPR/Cas9 系统可对植物基因组进行编辑，核酸酶Cas9 需要识别并结合靶
基因旁的特定短序列（PAM）才能对双链DNA 进行切割。科学家发现了ScCas9 酶，并做了相关研究。回
答下列问题：
(1)Cas9 酶需要识别并结合靶基因旁的PAM 序列才能发挥作用，体现了酶的 性，Cas9 酶破坏了
键。
(2)科学家对ScCas9 酶某位点氨基酸对应的密码子进行改造，使其更好地在水稻细胞中发挥作用，但没有
改变ScCas9 酶的氨基酸序列，这体现了密码子的 特点，对密码子进行改造，最终还必须通过
来完成。
(3)科学家利用农杆菌转化法把改造的ScCas9 基因整合进水稻细胞的染色体DNA 上，整合的机理是
。
(4)为了研究ScCas9 酶在水稻细胞中识别的PAM 序列及其偏好的PAM 序列，科研人员利用ScCas9 酶打靶
水稻细胞中含NAG、NCG、NTG（N 代表任意碱基）序列的若干基因，结果如下表所示。据表可得出的
结论有① ；② 。
PAM 序列
打靶基因
编辑效率
NAG
OsMPK15
0.00%
OsMPK16
91.18%
OsCPK7
94.74%
NCG
OsMPK17
0.00%
OsCPK5
0.00%
OsCPK6
46.67%
NTG
OsMPK9
7.14%
OsMPK15
0.00%
OsCPK7
0.00%
注：编辑效率是指靶基因被成功修改的个体占总处理个体的比例。
(5)水稻OsMPK16 基因的部分序列和CRISPR/ScCas9 系统对OsMPK16 基因编辑后的序列如下图所示，该
变异类型属于 。
85．（2025·广东广州·二模）不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS 是一段含多种限
制酶切割位点的DNA 序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS 自身序列也可能会启动下游基因的表
达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动
子的lacZ 基因和质粒p 构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题。
(1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶 切割质粒p-lacZ,然后将
MCS 与p-lacZ 连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS 列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、
p05、p06。
(2)将质粒p01~p06 分别与lacZ 基因缺失菌株混合后接种至含 的液体培养基中培养并筛选出成
功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果（如图乙）
表明，应选择质粒 并在 的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，
理由是 。
(3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒（记为pR)为
工具，用固体培养基初步比较外源启动子A 和B 的活性，试写出简要的实验思路 。
86．（2025·广东湛江·二模）研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的二酰甘油酰基转移酶
（DGAT1）基因导入四尾栅藻（操作过程如图），获得转基因的高产油脂四尾栅藻。利用地热废水培养该
藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题：
注：lacZ 基因编码产物在X-gal 和IPTG 存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。
(1)为保证从紫苏细胞中获得的DGAT1 基因与pMD19 克隆质粒相连，可在设计PCR 所用引物时，在引物
的 端加上特定限制酶的识别序列。第一次转化的受体细胞是大肠杆菌，结合该细胞的特点说明
这样做的目的是 。
(2)经转化的大肠杆菌可通过 （方法）接种到培养基上继续培养。为筛选目标菌株，培养基应加
入的成分有 。在该培养基中，目标菌株的菌落呈 色。
(3)启动子往往具有物种特异性，在载体pBI121 质粒中插入紫苏DCAT1 基因，其上游启动子应选择
（填
紫苏
“
DGAT1 基因
、
大肠杆菌
或
四尾栅藻
）的启动子。
”
“
”
“
”
(4)为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。该实验
不能说明转DGAT1 基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计： 。
表培养转基因四尾栅蕴的地热废水培养基各项指标测定结果
各项指标
总
氮//（mg·L-1）
总
磷//（mg·L-1）
氟化
物/（mg·L-1）
初始
23.2
4.32
4.56
培养转基因四尾栅藻11 天
后
1.9
0.45
0.84
87．（2025·山东聊城·二模）水稻花多且小，为两性花，育种工作量大。水稻雄性不育系为育种工作提供
了新路径。雄性不育株的雌蕊发育正常，但雄蕊发育异常，可接受外来花粉而繁殖后代。研究发现雄性育
性是由基因和环境共同控制的。杂交水稻的成功离不开雄性不育系的发现和应用。
(1)安农S-1 是我国发现的第一个温敏雄性不育系籼稻。该品系在高温条件下表现为雄性不育，低温条件下
可恢复育性。该温敏雄性不育系与多株野生型水稻进行正反交，得到的F₁ 均为雄性可育。F₁ 夏季炎热条件
下连续繁殖两代，得到的F₃ 中雄性不育系理论上所占比例是 。
(2)对野生型水稻中正常基因和安农S-1 突变体中的突变基因的非模板链碱基序列进行测序，结果如图。据
图分析突变体雄性不育的原因是
(3)若水稻野生型为雄性可育，突变品系甲和突变品系乙均为雄性不育（均只有一对基因与野生型不同）。
如表为3 个不同水稻杂交组合及其子代的表型及比例。
组合
杂交组合类型
后代的表型及比例
一
野生型×甲
全为雄性可育（杂种1）
二
野生型×乙
全为雄性可育（杂种2）
三
杂种1×杂种2
全为雄性可育
根据杂交组合一和二可知，雄性不育性状是由
①
性基因控制。根据杂交组合三，推测控制两个
突变体的相关基因为 （填
等位基因
或
非等位基因
）。
“
”
“
”
DNA
②
分子标记可以用于突变基因的定位，甲的6 号染色体上具有DNA 分子标记a，野生型的6 号染色体
上具有DNA 分子标记A。用A 和a 的特异性引物，对杂种1 自交后代中全部雄性不育植株组织中的DNA
进行PCR 扩增及电泳，结果出现I、
、
三种类型，如图所示：
Ⅱ
Ⅲ
该实验结果能确定甲的雄性不育基因 （填
是
或
否
）位于
“
”
“
”
6 号染色体上，理由是 。
(4)现有另一水稻品种，其育性性状由细胞核基因（R/r）和细胞质基因（N/S）共同控制，其中R 和N 为可
育基因，只要存在可育基因，雄配子就可育。雌配子的育性与上述基因无关，均是可育的。现有基因组成
为S（rr）的雄性不育品系甲，基因组成分别是N（rr）、S（RR）和N（RR）的三种雄性可育水稻品系乙、
丙、丁。
若以上述水稻为材料，应选择品系甲与
①
杂交，即可获得具有杂种优势的可育高产杂交种S
（Rr）。
若要长期培育杂交种，利用上述水稻品系，试写出培育方案：
②
。
88．（2025·山西太原·二模）水稻的花非常小，人工去雄难，但其杂交种优势明显。在生产中，科研人员
偶然发现了雄性不育水稻，已知雄性育性由等位基因F/f 控制，ff 为雄性不育。为了保留该雄性不育水稻，
科研人员构建含育性基因F、花粉致死基因P 和红色荧光标记基因M 的融合基因，并将其转入雄性不育植
株的与基因f 不同的染色体上，不仅使育性恢复，还能结合花粉致死基因与荧光标记基因精准控制杂交过
程，过程如图所示。请回答下列问题：
(1)构建该融合基因时，使用的工具酶有 。其中红色荧光标记基因M 的作用是 。
(2)将该融合基因转入雄性不育水稻细胞时，需要先 才能使其稳定存在并表达后发挥作用。
(3)该转基因植株产生的雌配子种类及比例为 。
(4)已知该水稻的高茎（D）对矮茎（d）为显性，且D/d 基因与F/f 基因、FPM 基因位于非同源染色体上。
欲在杂交过程中保留ddff 的雄性不育植株，甲同学设计了如图1 所示实验方案，乙同学评价该方案不可行，
请说明理由 。
(5)若将融合基因（FPM）导入基因型为Ddff 的水稻细胞中（如图2），培育成转基因植株。让该植株自交，
后代出现矮茎雄性不育植株的概率为 。
89．（2025·云南红河·二模）麦角硫因（EGT）是一种具有抗衰老、抗癌等多种生理功能的天然氨基酸。
科研人员从杏鲍菇中获取到了EGT 合成酶基因，通过基因同源重组的方法使基因在尿嘧啶营养缺陷型酿酒
酵母中进行高效表达，具体过程如下图所示。据图回答下列问题：
注：同源臂是用于引导外源DNA 片段与目标基因组发生同源重组的DNA 序列，这些序列与目标基因组的
两端具有高度同源性，从而促进外源DNA 片段的插入或替换。含有基因的酿酒酵母能在Sc-Ura 营养缺陷
培养基（缺少尿嘧啶）中正常生长。
(1)图中
过程为
①
，
过程与
过程所需原料
①
②
（填
相同
或
不相同
）。
“
”
“
”
(2)图中
过程是利用重叠延伸
③
PCR 将各元件连接在一起形成同源修复模板。下图是利用重叠延伸PCR 将
启动子和基因串联在一起的过程示意图，图中引物1 结合的部位是a 链的 端。由图可知，将启动子和
基因串联在一起的关键是 ，在将启动子和基因分别进行扩增时，不能将启动子和基因放在同一PCR
体系中反应，因为 。
(3)图中
过程是利用电击法将同源修复模板和质粒导入酿酒酵母中，在导入前应将酿酒酵母细胞处理为
④
的生理状态。
(4)同源修复模板进入酿酒酵母后会通过同源重组的方式插入到酿酒酵母基因组的Ⅵ-5 位点中，从碱基序列
的角度分析，此过程能准确进行的关键是同源臂1 与同源臂3，以及同源臂2 与同源臂4 均具有 的特
点。
(5)图中
过程是使用
⑤
Sc-Ura 营养缺陷培养基对酿酒酵母进行培养筛选，能在培养基中生长的酿酒酵母不
一定成功插入了基因，从细胞对外源DNA 分子进行转化的结果分析，原因是 。
90．（2025·山西·二模）马铃薯块茎在储存中极易受损褐变发黑，导致其外观、味道、安全性下降。多酚
氧化酶PPO 可催化酚类物质形成褐色物质，是导致褐变的关键酶。为培育抗褐化能力强，并符合基因安全
的新品种，研究者构建了目的基因StPPOi，表达产生与PPO 基因转录产物互补的RNAi。将目的基因搭载
在Gene—Deletor 载体上（重组载体如图1 所示），通过农杆菌介导，获得PPO 基因沉默的马铃薯植株。
经检测鉴定，发现褐变指数下降了80.78%。提取马铃薯器官中的外源基因，经PCR 扩增后电泳分离（结
果如图2 所示）。请回答下列问题。
(1)在构建的重组载体中，FLP 基因的表达产物与 酶的作用相似，均可以对DNA 进行切割；抗卡那
霉素基因的作用是 。
(2)转基因马铃薯植株块茎在25℃、3 天处理条件下，启动子 可以启动基因的转录，表达的产物可
阻断PPO 基因的 （填
转录
或
翻译
），从而抑制
“
”
“
”
PPO 的合成。
(3)转基因食品相对于传统食品，其有成本较低，农药使用量小，生产效率高等显著优势，但是转基因食品
的安全性始终受到人们的质疑。上述研究中可采用2℃、3 天处理此新品种，获得符合转基因安全的马铃
薯，理由是 。
91．（2025·陕西咸阳·二模）我国玉米的生产一直受到玉米螟虫害的严重影响，为提高玉米对玉米螟的抗
性，科学家通过基因工程将抗虫基因crylAb13 转入玉米，过程如图1 所示。回答下列问题：
(1)为了减少限制酶识别序列的影响，研究人员采用了新型的无缝克隆In-Fusion 技术实现重组载体的构建。
该技术首先要将表达载体线性化，需使用限制酶 ，其次要保证在目的基因两端构建出与线性化
载体末端相同的DNA 序列（即同源序列，通常15-20bp）。因此引物1 和引物2 要依据 序列设
计。
(2)将线性化的表达载体和基因crylAb13 混合进行In-Fusion 反应，In-Fusion 酶能够识别线性化DNA 片段
5'→3 末端任意16 个碱基，使其形成黏性末端，依靠同源序列碱基间的配对获得重组表达载体，其中同源
序列1、2 中碱基序列不同，这样设计的好处除了防止线性化载体自身环化自连外，还有 （答两
点）。
(3)过程
利用构建好的重组表达载体转化农杆菌，然后侵染玉米愈伤组织，进而获得转基因玉米植株。研
⑤
究人员探究农杆菌浓度对基因转化效率的影响，结果如图2 所示。实验结果表明，转化效率较高的农杆菌
浓度范围为 OD600。为了进一步对侵染条件进行优化，可进行实验探究的课题是 。
92．（2025·河南安阳·二模）科研人员常利用λ-Red 同源重组酶系统进行基因敲除、敲入等操作，其原理
是λ-Red 同源重组酶系统将一段携带同源序列的标记基因与特定靶序列进行同源重组，使靶基因被标记基
因置换下来，如图所示。回答下列问题：
(1)将pKD46 载体导入大肠杆菌时需用 Ca2+处理大肠杆菌，目的是 。检测大肠杆菌是
否含有pKD46 载体时，可依据pKD46 载体中的 的特性。
(2)PCR 时，HA1 和HA2 是依据 （填
靶基因
或
“
”
“NPTⅡ”）两侧的碱基序列而设计的。
(3)与构建基因表达载体相似，λ-Red 同源重组酶系统可将标记基因插入特定 DNA 片段中。据图分析，二
者的不同之处是 。
(4)检测靶基因是否敲除成功时，科研人员采取了以下两种方法：
PCR
①
。提取过程
处理后大肠杆菌中的
Ⅱ
DNA 分子，依据靶基因的序列设计引物进行PCR，用
方法检测 PCR 结果，若 ，则说明基因敲除成功。
培养基培养。从培养基成分角度，简要描述检测思路：
②
。
93．（2025·甘肃白银·二模）CRISPR-Cas9 技术在基因编辑中运用较多。该技术是以Cas9 基因和能转录出
与目标DNA 互补的向导RNA 的基因作为目的基因，通过载体将其导入受体细胞中。表达出来的Cas9 蛋
白和向导RNA 会形成复合物，向导RNA 识别并结合目标DNA，Cas9 蛋白切断双链DNA 形成两个末端。
这两个末端通过
断裂修复
重新连接，实现对目标
“
”
DNA 进行特定基因的敲除或插入，从而修复或改良
机体功能，其过程如图1。
(1)基因工程中可用PCR 技术获取目的基因，PCR 过程除了需要模板和引物外还需要的条件有 （答
出2 点即可）。若将一个Cas9 蛋白基因经PCR 扩增8 轮，获得的DNA 片段中仅含有1 种引物的DNA 片
段有 个。
(2)利用CRISPR-Cas9 技术在Gata 基因序列的一端插入绿色荧光蛋白（GFP）基因，Cas9 蛋白和向导RNA
复合物相当于限制酶，会破坏Gata 基因序列上的 键，插入GFP 基因后，构建了图2 中的重组质粒，
其中终止子的作用是 。为了检测GFP 基因是否准确插入图2 中的位置，最好选择引物 （填序
号）进行PCR 扩增，然后利用电泳技术进行检测。
(3)实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。
对小鼠体细胞DNA 进行PCR 和电泳分析，得到如图3 的1～3 种条带结果，其中第 种条带的结果为
Gata3-GFP 基因纯合子的小鼠，理论上子代中Gata3-GFP 基因纯合子的比例为 。
94．（2025·北京海淀·二模）为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研
究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。
(1)将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先
用 处理大肠杆菌。
(2)PE 基因编码的PE 酶催化E 蛋白磷酸化，磷酸化的E 蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖
后E 蛋白去磷酸化。M 蛋白是一种转录抑制因子。R 作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP 基因和PE
基因等元件，工作过程如图1、图2。
据图
①
1、图2 可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E 蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，推测M 蛋白
，PE 表达产物可使E 蛋白重新磷酸化。
在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，
②
R 均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理
。
在含有葡萄糖的培养基中培养转入
③
R 的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测 和荧光强度。若结
果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。
(3)在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R 监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏
多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C 基因编码的蛋白C 可结合启
动子Pc，促进RNA 聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C 蛋白无法结合Pec，Pc 无法启动下游
基因转录。研究者将R 的启动子Р 更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补
充不同条件下，2 个调控元件对R 的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。
条件
Pc 中C 蛋白的结合序列
M 蛋白的结合序列
无葡萄糖
+
+
低浓度葡萄糖
．
ⅰ
．
ⅱ
高浓度葡萄糖
．
ⅲ
．
ⅳ
95．（2025·江西九江·二模）小鼠中编码类胰岛素生长因子的Igf2 基因，位于7 号常染色体上，对个体生
长发育具有重要的作用。当Igf2 突变为Igf2m 后会失去原有功能，产生矮小型小鼠。科研人员进行了如下
表的杂交实验。回答下列问题。
杂交实验
父本基因型
母本基因型
子代表现型
实验一
Igf2/Ifg2
Igf2m/Igf2m
正常型小鼠
实验二
Igf2m/Igf2m
Igf2/Igf2
矮小型小鼠
(1)产生矮小型小鼠的变异类型是 ，在遗传和进化方面，该变异类型的意义是 （回答1 点即
可）。
(2)研究表明，上述杂交实验的遗传现象与基因的甲基化修饰有关。已知甲基化的基因在体细胞有丝分裂中
终生保持，但在减数分裂中，配子形成之前会先被去甲基化，再根据相应的性别，在生殖细胞中重新被甲
基化修饰。据此推测实验二中子代表现为矮小的原因可能是 。若将实验一子代中的正常型雌雄小
鼠自由交配，理论上其子代表现型及比例为 。
(3)进一步研究发现，Igf2 基因的表达还与7 号染色体的H19 基因及两个基因之间的绝缘子（由500 个碱基
对组成，碱基对单位：bp 有关。正常型纯合小鼠杂交后代中，只有来自父本的Igf2 基因表达，而来自母
本的Igf2 基因不表达，调控机制如下图所示。在母本染色体上，未甲基化的绝缘子与CTCF 蛋白特异性结
合，从而 （填
促进
或
抑制
）增强子激活
“
”
“
”
Igf2 的表达。在父本染色体上， 被甲基化
修饰，进而促进Igf2 基因的表达。
备注：绝缘子和增强子均为一段调控基因表达的DNA 序列，Me—指的是甲基化修饰。
(4)在正常型纯合小鼠杂交实验中，偶然发现在后代的体细胞中，来自父本和母本的Igf2 基因都有相同的表
达活性，推测这是由母本染色体上的绝缘子序列部分缺失所致。请利用基因工程中的相关技术，设计实验
加以验证（简要写出实验思路和预期结果）。
实验思路： 。
预期结果： 。
96．（2025·江苏南通·二模）红斑丹毒丝菌是猪的病原性细菌（引起猪丹毒），其表面抗原A 蛋白
（SpaA）和胆碱结合蛋白B（CbpB）能诱导猪等产生特异性抗体。枯草芽孢杆菌是一种益生菌，为猪丹
毒口服活载体疫苗的研发奠定基础。研究人员构建重组质粒（过程如图1）导入枯草芽孢杆菌，一段时间
后分别收集菌体和芽孢（抗逆性强，适宜条件下能萌发形成菌体），制备在菌体表面表达SpaA 的重组菌
体活载体疫苗、芽孢表面表达CbpB 的重组芽孢活载体疫苗，并通过小鼠免疫实验评价免疫效果。请回答
下列问题：
(1)已知引物R1 与引物F2 部分序列互补配对，以便合成融合基因spoⅢJ-spaA。其中R1 的序列为5'-
GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTTTCT-3'，则PCR2 过程中构建
的引物F2 的序列为 。
5'-GAGGAGCGAAAACCGAGAGACTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3'
①
5'-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3'
②
5'-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3'
③
5'-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3'
④
(2)已知过程
、
都用双酶切构建重组质粒，则设计
⑦
⑧
PCR1 时在引物F1 的 端添加的限制酶识别序
列是 。质粒pDC 中BamHⅠ和EcoRⅠ之间的长度 （填
大于
、
小于
或
等于
）
“
”
“
”
“
”
MfeⅠ
和BelⅠ之间的长度。过程
、
不能同时在同一体系中进行的主要原因是
⑦
⑧
，若同时进行，酶切后的
连接产物多。
(3)将重组质粒pDG-CBJA 导入枯草芽孢杆菌，将发生如图2 所示的同源重组过程，pDG 中的序列A、序列
B 的设计依据是 。
(4)对转化的枯草芽孢杆菌进行筛选时，应将菌种接种在含壮观霉素和 的平板上，37℃培养24h，加
碘液，3min 后弃去碘液，观察菌落周围有无透明圈产生，选择 的菌落来制备疫苗。
(5)科研人员研究了不同疫苗体液免疫应答的效果，结果如图3，A 组为磷酸缓冲液，B 组为野生型枯草芽
孢杆菌菌体，C 组为野生型枯草芽孢杆菌芽孢，D 组为重组枯草芽孢杆菌菌体活载体疫苗，E 组为重组枯
草芽孢杆菌芽孢活载体疫苗。
五组实验中，
①
组为对照组。
小鼠口服菌体活载体疫苗（表达
②
SpaA）后，血清抗SpaA 抗体低；芽孢活载体疫苗不表达SpaA，但小
鼠口服芽孢活载体疫苗后血清抗SpaA 抗体较高，其原因是 。
97．（2025·内蒙古赤峰·二模）NOV 基因过量表达可促进神经干细胞向神经元分化，并为中枢神经系统再
生修复提供适宜的微环境。为探究NOV 基因过量表达诱导皮肤干细胞向神经元细胞分化，研究者构建了
NOV 基因表达载体并进行了相关研究。
(1)在构建NOV 基因克隆载体时，要根据 设计引物，若引物中GC 含量高，长度较长时，PCR 时应
（填
提高
或
降低
）复性温度，有利于
“
”
“
”
。
(2)大部分PCR 产物的3′末端有一个“A”，而M 质粒经EcoRV 酶切后，再在两端的3′末端添加“T”而成为
T 载体。PCR 产物A 末端与T 载体的T 末端连接，此过程称为TA 克隆。与传统的酶切法构建重组质粒相
比，TA 克隆具备的优势有 ，从DNA 分子连接方向的角度分析，TA 克隆的局限是易出现 。
(3)将大肠杆菌培养在含 的培养基上生长，导入含NOV 基因的M 重组质粒的大肠杆菌呈白色菌落，
原因是 。
(4)构建NOV 基因真核表达载体时，用限制酶分别切割含NOV 基因的M 重组质粒和真核表达载体N 质粒，
实现N 质粒与NOV 基因的连接。N 质粒上的启动子连接有绿色荧光蛋白基因，外源基因插入后，表达的
最终产物为目的蛋白与荧光蛋白的融合体。若要观察目的蛋白在细胞中的定位，利用N 载体的优势是
。
(5)根据以上信息，写出检测NOV 基因表达能否诱导皮肤干细胞向神经元细胞分化的实验思路： 。
