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PCR 技术的原理及其应用 一、PCR 技术的原理 (一)PCR 技术“引物”归纳分析 1．引物的设计 典例1 PCR 扩增Bt 抗虫蛋白基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会抑 制引物与模板的碱基配对，复性温度过低会增大引物与DNA 模板链发生错配的概率。复性 温度的设定与引物长度、碱基组成有关。 (1)PCR 扩增Bt 抗虫蛋白基因时，设计引物的依据是Bt 抗虫蛋白基因两端的部分核苷酸序列 ， 引物与Bt 抗虫蛋白基因模板链的3 ′ 端的部分序列互补配对。 (2)复性温度越低，产物特异性越低，扩增效率越高。 (3)引物长度越短，产物特异性越低。 (4)引物的长度相同时，GC 含量越高，需要设定的复性温度越高。 (5)某同学设计两组引物(只标注部分碱基序列)都不合理。请解释原因： 提示 第1 组引物之间有连续多个碱基互补，导致引物Ⅰ和Ⅱ之间碱基互连形成引物二聚体， 第2 组引物自身有连续多个碱基互补，导致引物自身内部碱基互连形成发夹结构，都会影响 引物与模板的结合。 归纳提升 引物设计原则 ①引物长度要适宜，通常为20～30 个核苷酸。②引物GC 含量要适宜，一般为45%～ 55%。③复性温度要适宜。④引物自身及引物之间不应有连续的多个碱基互补。 2．引物的修饰 典例2 引物用PCR 技术将DNA 分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部 位如图所示，X 为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA 片段是图中的( ) 答案 D 解析 在第一次PCR 循环结束后，得到以引物Ⅱ延长产生的单链，在以后的PCR 循环中， 以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA 时，引物Ⅱ上的X 片段也被作为 模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增，实验结束得到的绝大部分DNA 片 段是选项中的D。 典例3 (2022·山东，25 节选)某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶 识别并降解，药物A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的 机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P 和FLAG－PΔ。PΔ 是缺失特定氨基酸序列 的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或PΔ 的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介 质结合，但不影响P 或PΔ 的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物 需满足的条件是_________________________________________________________________， 为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序 列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。 ②PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因， 如图所示，其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合 基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因 对应的氨基酸序列与P 不同。据图分析，出现该问题的原因是_________________________ ______________________________________________________________________________。 修改扩增P 基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 _______________________________________________________________________________。 答案 ①能与P 基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5′端 ②P 基 因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA 的密码子被错位读取 在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1 个碱基 解析 ①引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩 增P 基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA 聚合酶延 伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加 在引物的5′端。②融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基 酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同，说明P 基因翻译时出错。由图可看出， 在转录出的mRNA 中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P 基因对应的第一个碱基构 成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoR Ⅰ识别序列 3′端添加1 个碱基，使其碱基数目加上FLAG 的碱基数目为3 的倍数，这样能保证P 基因 转录出的mRNA 上的读码框不改变，能够正常翻译。 3．引物的结合方向 典例4 如图为X 蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X 蛋白基因所需的引物序列是________________；________________。 答案 5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′ 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′ 解析 书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板 链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧， 3′端在左侧，引物序列为5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推测另外一条引物的序列。 4．引物的数量计算 典例5 (1)如图：一个DNA 分子n 次扩增，则： ①子代DNA 分子中双链不等长的DNA 分子数为________个； ②子代DNA 分子中双链等长的DNA 分子数为________个； ③子代DNA 分子中含模板链DNA 分子数为________个； ④子代DNA 分子中含引物A(或B)的DNA 分子数为________个； ⑤复制过程中共需引物________个； ⑥第n 次复制需要引物________个。 (2)已知引物1 及引物2 之间的序列为目的序列，若引物与DNA 的结合位点如图所示，在第 ________轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 答案 (1)①2n ②2n－2n ③2 ④2n－1 ⑤2n＋1－2 ⑥2n (2)2 (二)PCR 产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳 典例6 (2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的 是( ) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来 答案 A 解析 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA 分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度 通常是根据所需分离的DNA 片段大小来选择的，对于较大的DNA 片段，比如基因组DNA 或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移，而 对于较小的DNA 片段，比如PCR 产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以 提供更好的分辨率和分离效果，A 正确；凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指 示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA 分子的具体位置，B 错误；DNA 片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，DNA 迁移方向为从负 极向正极，C 错误；琼脂糖凝胶中的DNA 分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来，D 错误。 归纳总结 DNA 电泳鉴定中的“两液”“两剂” 两液：电泳缓冲液和凝胶载样缓冲液 项目 电泳缓冲液 凝胶载样缓冲液 功能 维持整个电泳体系的pH 稳定，提供 导电介质，影响物质的电泳迁移率 主要用于样品的稀释和保护，同时 通过指示剂指示样品在凝胶中的位 置 使用 时机 整个电泳过程中都需要 在样品加样前与样品混合使用 两剂：核酸染料与指示剂 项目 核酸染料 指示剂 举例 溴化乙锭 溴酚蓝 功能 用来染色DNA 或RNA 分 子，以便在紫外灯下观察 和检测核酸条带 在电泳过程中，溴酚蓝通常位于样品的 前沿，形成一个明显的蓝色条带，这有 助于实验者判断电泳是否完成，以及何 时停止电泳 拓展阅读 蛋白质电泳的原理 电荷驱动迁移：蛋白质在溶液中携带净电荷(取决于周围pH 与其等电点pI 的关系，等电点 pI 是蛋白质在溶液中净电荷为零时的pH)，在电场中向相反电极移动。例如：在pH 8.3 的缓 冲液中(pH>多数蛋白质的pI)，蛋白质带负电，向正极移动。 凝胶筛效应：凝胶作为分子筛，小分子蛋白质迁移快，大分子被阻滞，实现按分子量分离， 如SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。 二、PCR 技术的应用 (一)利用PCR 技术鉴定目的基因的连接方式 典例1 为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行 PCR 鉴定。如图所示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应 选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了 400 bp 片段，原因是___________________________________________________________。 答案 乙和丙 目的基因反向连接 (二)利用重叠延伸PCR 技术引导基因定点突变 典例2 如图为利用重叠延伸PCR 的方法在蛋白a 基因中部引入定点突变(A/T 碱基对变为 G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D 与蛋白a 基因的两端完全配对，引物 B、C 虽与蛋白a 基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独 立的PCR 达到目的。回答下列问题： (1)PCR1 所用引物应为____________ 。PCR1 和PCR2 必须分开进行的原因是 ______________________________________________________________________________。 得到图中由c、d 链构成的完整DNA 分子至少需要PCR2 进行________次循环。 (2)将PCR1、2 的产物混合后，继续进行下一次PCR 反应。在该PCR 反应中经过高温变性 后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA 链相互结合，理论上有________种结合的 可能，其中能进行进一步延伸的有____种。 (3)PCR3________(填“需要”或“不需要”)额外加入引物，PCR4 的作用是大量扩增突变基 因，该过程所用引物是____________。 答案 (1)引物A 和B 引物B 和引物C 存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会发生 碱基互补配对导致引物失效 2 (2)4 1 (3)不需要 引物A 和D (三)利用重叠延伸PCR 技术构造融合基因 典例3 融合PCR 技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法， 其过程如图1 所示。图2 是中间载体1 和中间载体2(利用融合PCR 技术构建成)构建成叶绿 体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通 过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA 上的特定位点上。请据图回答 下列问题： (1)图1 第二阶段中引物2 与引物3 部分碱基的____________关系使得两条DNA 链能成功 “搭桥”连接起来。 (2)若通过融合PCR 技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计 ________种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有______种。 (3)图2 中需使用________________(填限制酶)和DNA 连接酶将两中间载体构建成定点整合 表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。 答案 (1)互补配对 (2)8 6 (3)Spe Ⅰ、Sal Ⅰ 复制原点 解析 (2)由图1 可知，通过融合PCR 技术，每一次将两个DNA 片段拼接起来，需要4 种引 物，其中有2 种起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR 技术将启动子、标记基因、 目的基因、终止子拼接起来，需要设计8 种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6 种。 (3)由图2 可知，启动子和终止子的两端分别有Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重 组基因1 与2 之间也存在Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，因此图2 中需使用Spe Ⅰ、Sal Ⅰ 和DNA 连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的 结构是复制原点。 (四)利用反向PCR 技术扩增未知基因序列 典例4 如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 方法，简捷地分析出已知序列两侧的序 列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请回答下列问题： (1)如表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是 ________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。 名称 DNA 序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 5′-AACTATGCGCTCATGA－－－－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′ 3′-TTGATACGCGAGTACT－－－－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′ 引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ (2)对产物测序，经分析得到了片段F 的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷 酸序列)，结果正确的是________。 A．5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′ B．5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′ C．5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′ D．5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′ 答案 (1)②④ (2)B 解析 由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若 要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR 技术。反向PCR 的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA 连接酶将其 连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物， 以环状DNA 两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用Taq DNA 聚 合酶无法将DNA 连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。(1)采用反向PCR 扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′→3′ ，可根据已知序列3′- AGTACTCGCGTATCAA-5′和3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，设计对应PCR 引物是 5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′。(2)对产物测序，得到 片段F 的完整序列，因为片段F 是被限制酶EcoR Ⅰ剪切后得到的，所以片段F 的5′端是 AATTC，故选B。 (五)“双脱氧法”基因测序 典例5 (2024·湖南，15 改编)最早的双脱氧测序法是在PCR 反应体系中，分别再加入一种 少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三 磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止； 若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测 序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述错误的是( ) A．上述PCR 反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越大，迁移速率越慢 C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为G 答案 D 解析 利用双脱氧测序法时，PCR 反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入 一种引物，A 正确；电泳时，产物的DNA 片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B 正确；根据题图可知，对照个体PCR 子链的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，该序列 与对照个体双链DNA 分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′- CTACCTGTGAT-3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T，C 正确，D 错 误。 原理解读 (1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR 延伸所需的3′-OH，因此每当DNA 链 加入分子ddNTP 时，延伸便终止。(2)每一次DNA 测序是由4 个独立的PCR 反应组成的，4 个PCR 反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA 聚合酶，唯一不同的是4 个反应体系分别 加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR 反应后，在反应体系中就 形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA 片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到 放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。(4)双脱氧法原理示意 图： (六)实时荧光定量PCR 典例6 实时荧光定量PCR 简称qPCR，灵敏度高、特异性好，是目前检测微小残留病变的 常用方法。将标有荧光素的Taqman 探针与待测样本DNA 混合后，在变性、复性、延伸的 热循环中，与待测样本DNA 配对结合的Taqman 探针被Taq 酶切断，在特定光激发下发出 荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度， 可得Ct 值。 (1)做qPCR 之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1 对引物和______种Taqman 探针。 (2)设初始目的基因有m 个，扩增n 次，需消耗探针____________个。 (3)Ct 值的含义：在PCR 扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经 历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct 值就________。 答案 (1)1 (2)m(2n－1) (3)越小 课时精练 [分值：100 分] [1～8 题，每题5 分，共40 分] 一、选择题 1．科学家在人类的基因中发现36 种病毒基因的片段，并提取相关基因片段利用PCR 技术 进行扩增。下列叙述错误的是( ) A．用PCR 扩增仪进行扩增时，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋ B．PCR 反应体系中添加的DNA 聚合酶的最适温度是92 ℃ C．基因片段扩增过程中，脱氧核苷酸会依次加到引物的3′端 D．标准PCR 反应体系方法扩增目的基因一定要设计出2 种引物 答案 B 解析 PCR 过程一般经历下述多次循环：超过90 ℃变性(使模板双链DNA 解聚为单 链)→50 ℃左右复性(引物与DNA 模板链结合)→72 ℃左右延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。 因此，PCR 反应体系中添加的DNA 聚合酶的最适温度是72 ℃，B 错误。 2．(2025·武汉调研)PCR 技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链 形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值。下列叙述正确的是( ) A．引物与模板链的结合属于延伸过程 B．变性过程的温度一般要低于复性过程 C．复性过程的温度应设置为略低于Tm值 D．引物的Tm值越接近，引物之间越容易结合 答案 C 解析 引物与模板链的结合属于复性过程，A 错误；变性过程的温度一般要高于复性过程， 变性的目的是使双链DNA 解聚为单链，B 错误；引物与其模板链形成的杂合分子的解链温 度称为引物的Tm值，复性过程的温度应设置为略低于Tm值，否则会导致解螺旋的发生，C 正确；PCR 过程中，选用的2 种引物往往Tm值是一样的，这是为了让2 种引物在相同的复 性温度下都能有效结合模板，而引物之间的结合主要取决于碱基序列的互补性，D 错误。 3．(2025·武汉调研)重叠延伸PCR 技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为 模板，经过多次PCR 扩增，从而获得目的基因的方法，过程如图。下列叙述错误的是( ) A．引物中G、C 的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增 多 B．第一阶段中引物2 和引物3 容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中 C．加入引物1、2 的反应系统和加入引物3、4 的反应系统中各进行1 次PCR，共产生4 种 DNA 分子 D．引物1、2 组成的反应系统中，经第一阶段要形成图中同时含有引物1、2 的双链DNA 分子，至少要经过2 次复制 答案 C 解析 G 与C 之间形成三个氢键，引物中G、C 的含量越高，与模板链形成的氢键越多，复 性温度设置得越高；当设置温度过低，会造成引物与模板链的结合位点增加，导致非特异性 条带增多，A 正确；由图可知，引物2 和引物3 分别与目的基因两条链的相对应位置结合， 因此二者之间存在碱基互补配对片段，为防止扩增时引物2 与引物3 之间进行配对，需将其 置于不同反应系统中，B 正确；引物1 和2 位于一个反应系统中，引物3 和4 位于另一个反 应系统中，这两个反应系统各进行1 次PCR，引物1 扩增的DNA 分子与引物4 扩增的DNA 分子相同，因此只能产生3 种双链DNA 分子，即引物1(或4)扩增的双链DNA 分子，引物2 扩增的双链DNA 分子，引物3 扩增的双链DNA 分子，C 错误；引物2 与目的基因的相应模 板链结合，可形成一个含引物2 的双链不等长的DNA 分子，该DNA 分子中引物2 所在的那 条链再与引物1 结合即可扩增获得同时含有引物1 和引物2 的双链等长的DNA 分子，因此 至少需要经过2 次复制，D 正确。 4．(2025·成都树德中学检测)DNA 分子杂交时，常需要大量的单链DNA 探针。不对称PCR 是一种常见的单链DNA 探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。 假设在PCR 反应的早期10 个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后， 数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA 单链。下列叙述正确的是( ) A．若a 链为所需的DNA 分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅲ B．进行最初10 个循环的目的是将限制性引物消耗完，以保证获得大量的单链DNA 探针 C．设计较长的限制性引物与较短的非限制性引物，以便于后阶段通过提高温度来控制产物 生成量 D．如果体系中原模板DNA 的数量为m，共进行25 次循环，则最终获得的单链探针数为 15×210m 答案 D 解析 由于DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链，引物Ⅱ和Ⅲ不能作为扩增探针序列的引 物，若a 链为所需的DNA 分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅳ，A 错误；进行最初10 个循环的目的是增加模板DNA 的量，以便后期更快得到较多数量的单链DNA 探针，B 错误； 引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏，因此可设计较短的限 制性引物与较长的非限制性引物，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合，从 而提高产物生成量，C 错误；如果体系中原模板DNA 的数量为m，最初10 次循环产物为双 链DNA 分子共210×m 个，其中有210×m 个b 链，以这些链为模板，利用引物又进行了15 次循环，每次循环生成的都是a 链，不改变b 链的数目，即b 链的数量每次循环开始都是 210×m 个，15 次循环每次生成a 链的数量也是210×m 个，故最终获得的单链探针数共为 15×210×m 个，D 正确。 5．关于DNA 片段的扩增及电泳鉴定的实验，下列叙述错误的是( ) A．PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌 处理 B．根据待分离DNA 片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，加热到熔化，稍冷却后 加入核酸染料混匀 C．电泳鉴定PCR 产物时凝胶载样缓冲液中的指示剂可提示终止时刻 D．－20 ℃储存的小份缓冲液和酶，使用前从冰箱拿出，需要缓慢融化 答案 A 解析 PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理， 移液器不需要进行高压灭菌处理，A 错误；电泳鉴定PCR 产物时加样缓冲液中的指示剂溴 酚蓝迁移速度较快，可提示电泳的终止时刻，C 正确；PCR 所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后， 应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不 被破坏，D 正确。 6．(2025·驻马店期末)ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)缺少3′羟基，无法形成新的磷酸二酯键， 能使DNA 链的延伸终止，因此常被用于DNA 测序。某实验室欲利用PCR 技术对某DNA 进 行测序，已知参与反应的物质有被测序的DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸)、引物、相关酶等， 且不同ddNTP 参与反应的结果如表所示，其中“■”代表引物。下列叙述正确的是( ) ddNTP 类型 子链类型 ddATP ■— GATTCGAGCT GddATP ■—GATTCGddATP ■—GddATP ddCTP ■— GATTCGAGdd CTP ■—GATTddCTP ddGTP ■— GATTCGAGCT ddGTP ■—GATTCGAddGTP ■—GATTCddGTP ■—ddGTP ddTTP ■— GATTCGAGCd dTTP ■—GATddTTP ■—GAddTTP A.题中相关酶包括解旋酶、DNA 聚合酶等 B．若不考虑引物，则被测的DNA 的序列应为5′－CTAAGCTCGACT－3′ C．引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列相同 D．dNTP 可为DNA 复制提供原料和能量 答案 D 解析 PCR 利用温度进行解旋，不需要解旋酶的参与，A 错误；ddNTP 的3 号碳上没羟基， 参与聚合反应后无法与游离脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，因此ddNTP 一旦参与聚合反应， 则DNA 单链延伸即终止，因此可知第一个G 所在位置为3′端(第一位)，依据图中碱基的 排序可知，图中子代DNA 的碱基序列是5′－GATTCGAGCTGA－3′，则被测的DNA 的 序列应为3′－CTAAGCTCGACT－5′，B 错误；引物的碱基序列与模板链的3′端的一段 碱基序列是互补关系，C 错误。 7．巢式PCR 是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大 的DNA 片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以 扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因，如图所示。下列叙述错误的是 ( ) A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA 片段 B．第二轮PCR 反应能否进行，是对第一轮PCR 反应正确性的鉴定 C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 答案 D 解析 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA 片段，以便与模板链互补配对，A 正确；第二轮PCR 使内引物以第一轮PCR 产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR 反应能否 进行，是对第一轮PCR 反应正确性的鉴定，B 正确；如果两套引物一起加入反应体系中， 外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D 错误。 8．某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的 dsred2－amy 融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(灰色区域)可互 补配对。下列叙述错误的是( ) A．利用PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA 双链 B．不能在同一反应体系中进行dsred2 基因和amy 基因的扩增 C．dsred2 基因和amy 基因混合后只能得到一种类型的杂交链 D．杂交链延伸得到dsred2－amy 融合基因的过程不需要加引物 答案 C 解析 利用PCR 技术扩增基因时，高温变性使DNA 双链解旋，不需要解旋酶来打开DNA 双链，A 正确；引物②和引物③中部分序列可互补配对，引物之间的结合会干扰引物和模板 链的结合，从而影响PCR 过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy 基因 的扩增，B 正确；dsred2 基因和amy 基因混合可以得到两种类型的杂交链，C 错误；杂交链 延伸得到dsred2－amy 融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序 列即为引物，可以作为子链合成的引物，D 正确。 二、非选择题 9．(18 分)(2025·山东，25)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用 农杆菌转化法将Ti 质粒上的T－DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关 基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信 息已知。 (1)Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为____________________。选用图甲中 的SmaⅠ对抗除草剂基因X 进行完全酶切，再选择SmaⅠ和__________对Ti 质粒进行完全 酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是__________。利用DNA 连接酶将酶切后 的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠 杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶__________进行完全酶切并电泳检测，若 电泳结果呈现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为__________bp，则一定为正向重组质 粒。 (2)为证明这两个突变体是由T－DNA 插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组 DNA，经酶切后产生含有T－DNA 的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR 难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为__________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的 限制酶，且T－DNA 中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段__________，才能利 用引物P1 和P2 成功扩增未知序列。PCR 扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以 判断出2 条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为____________________(填“琼脂 糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生 型基因，____________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 答案 (1)复制原点 Xba Ⅰ DNA 聚合酶 Spe Ⅰ、Sma Ⅰ 550 (2)4 连接成环(或环 化) 测序和序列比对 (3)不能 解析 (1)Ti 质粒和普通质粒一样，具有复制原点，与其在宿主中的复制能力密切相关。选 择载体上的酶切位点，首先BamH Ⅰ不能选，因为涉及终止子序列被切开；其次，能与 SmaⅠ组合的只剩下XbaⅠ和PstⅠ，这两个限制酶能切出黏性末端；第三，涉及要补平黏 性末端，只有XbaⅠ切出的黏性末端(5′端突出的末端)可以作为模板，在DNA 聚合酶的催 化下，从其互补链的3′端开始连接脱氧核苷酸补平黏性末端，如图1 所示；而PstⅠ切出 的黏性末端是3′端突出的末端，无法作为模板，无法从其互补链的5′端开始连接脱氧核 苷酸，如图2 所示。 首先，补平的载体和SmaⅠ切割的抗除草剂基因X 既可以正向连接也可以反向连接；其次， SmaⅠ切出的平末端和补平的XbaⅠ的黏性末端连接后形成的重组位点，两个限制酶识别序 列消失，另一边2 个SmaⅠ位点连接后形成的重组位点仍然能保留该酶切位点；第三，能 切出较准确片段的只剩下SmaⅠ和目的基因内的SpeⅠ两个酶切位点；第四，在进行目的基 因和载体连接过程中，由于使用了单酶切，因此，存在载体自连、载体串联、载体和单一基 因连接及载体和串联基因连接等情况，但无论何种连接方式，只有单基因和单载体的连接片 段在SmaⅠ和SpeⅠ切割下能出现一长一短两条带，且短的条带约为550 bp 才是正向连接 (图3)，而反向连接的片段切出的较短条带是200 bp(图4)。 (2)PCR 扩增的目标片段大小限制以及扩增的区域是两个引物之间的限定片段。根据题意， 一方面要求限制酶能在基因组中切割更多更小的片段，识别序列长度为4、6、8 个碱基对的 限制酶在基因组中理论上分别为每44、46、48碱基对区域内会有一个酶切位点。因此，选择 识别序列为4 个碱基对的酶切割小麦基因组可产生更短的切割序列，连接后有利于后续PCR 进行。另外，要对图乙的未知序列进行扩增，只有连接成环后，才能形成两个引物之间的扩 增目标区，无论串连还是自连，都可以达到扩增引物之间区域的目的。琼脂糖凝胶电泳只能 判断产物的有无或大小，但无法确定碱基序列，所以不能用于判断是否属于同一个基因。测 序可以确定碱基序列，要确定两个片段是否属于同一个基因，进行序列比对即可。(3)如果 在突变体中检测到野生型基因存在，只能说明该基因已经整合进突变体基因组中。外源野生 型基因只有在突变体中正确表达才可能恢复野生型性状。因此，仅凭检测到野生型基因不足 以确定该植株的表型为野生型。 10．(22 分)(2025·南阳模拟)胰岛素的单体具有生物功能，二代胰岛素制剂由于易形成二聚体 或六聚体而功能降低。如果将胰岛素B 链28 位脯氨酸与29 位的赖氨酸交换位置，能有效抑 制胰岛素聚合。已知基因上相应转录非模板链(a 链)序列为5′—CCCAAG—3′，脯氨酸密 码子为CC(A、U、C、G)，赖氨酸的密码子为AA(A、G)，科研人员希望通过PCR 实现对 目的基因的改造(过程如图1)，再通过农杆菌将改造后的基因导入番茄中，利用番茄果实生 产三代胰岛素，该过程所用Ti 质粒部分结构如图2 所示，其中潮霉素抗性基因在真、原核 细胞中均可表达，卡那霉素抗性基因在原核细胞中表达。回答下列问题： (1)若改变最少碱基数量，则图1 中引物C 中不能与模板链配对的碱基序列为________，该 设计利用了密码子的________特点，除具有与模板链不配对的序列外，引物B、C 与普通引 物的主要区别是________________________。 (2)PCR3 过程所用的模板链是____________，扩增时是否需要添加引物？________(填 “是”或“否”)，原因是________________________________________________________。 (3)PCR4 选用的引物为________，若保证改造后的目的基因能正确拼接到Ti 质粒上，这两 种引物需要分别添加限制酶____________的识别序列。图2 中连接目的基因的启动子需要改 造为________________________的启动子。 (4)在农杆菌和番茄细胞的培养基中分别加入_______、_______可以筛选出发生转化的细胞。 答案 (1)AAACC(或AAGCC) 简并性 引物B、C 之间有碱基互补配对序列 (2)b 链和c 链 否 b 链为模板时c 链承担引物作用，c 链为模板时b 链承担引物作用 (3)A、D XbaⅠ、SacⅠ 番茄果实中特异性表达的基因 (4)卡那霉素(或潮霉素) 潮霉素 解析 (1)应该将非模板链的5′－CCCAAG－3′顺序改为5′－AAA(G)CCG(A、T、C)－ 3′，若改变最少碱基数量，则最后一个碱基G 不变，所以图1 中引物C 中不能与模板链配 对的碱基序列为AAACC 或AAGCC。该设计利用了密码子的简并性特点，除具有与模板链 不配对的序列外，引物B、C 与普通引物的主要区别是B、C 引物之间有碱基互补配对序列， 通过碱基互补配对序列将PCR1 和PCR2 的产物拼接在一起。(2)因为子链只能从引物5′端 向3′端方向延伸，所以PCR3 时b 链为模板时c 链承担引物作用，c 链为模板时b 链承担引 物作用，扩增时不需单独添加引物。(3)PCR4 选用的引物为A、D，这样才能扩增出完整的 新基因片段。图2 中箭头方向为基因转录的方向，目的基因a 链为非模板链，所以引物A 的 5′端为转录起始端，又因为目的基因需要插入T－DNA 序列，所以若保证改造后的目的基 因能正确拼接到Ti 质粒上，这两种引物需要依次添加限制酶XbaⅠ、SacⅠ的识别序列。图 2 中目的基因应连接番茄果实中特异性表达的基因的启动子才能在番茄果实中表达。 11．(20 分)(2025·成都一模)药物A 是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿 病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。回 答下列问题： (1)科学家根据药物A 的氨基酸序列人工合成DNA 片段，由于_________________________， 该方法得到的DNA 片段有多种可能，也可以用PCR 技术从植物细胞中扩增出药物A 基因， 该技术的原理为________________。 (2)如图1 表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点(限制 酶的识别序列和切割位点如表所示)，其中LacZ 基因表达的产物可将无色物质X－gal 催化 为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。 限制酶 识别序列和切割位点 BamHⅠ 5′－G↓GATCC－3′ EcoRⅠ 5′－G↓AATTC－3′ Sau3AⅠ 5′－↓GATC－3′ SmaⅠ 5′－CCC↓GGG－3′ XmaⅠ 5′－C↓CCGGG－3′ ①利用PCR 技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如图2，扩增时 选用的两种引物碱基序列为(注明序列的5′端和3′端)______________、______________。 ②分析图1，为将目的基因准确插入质粒中，最好选用________________酶切割目的基因， 酶切处理后的目的基因和质粒需使用________(填“T4”“E.coli”或“T4 或E.coli”)DNA 连接酶处理，才能得到重组质粒。 ③将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要将其培养在添加了 ____________ 的培养基上。含有重组质粒的目标菌落将呈现________ 色，原因是 ____________ ______________________________________________________________________________。 ④若将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为 ____________bp 的条带。 答案 (1)一种氨基酸可能由多种密码子编码(或密码子具有简并性) DNA 半保留复制 (2)①5′－TCTGTT－3′ 5′－CTTGGA－3′ ②BamHⅠ和XmaⅠ T4 或E.coli ③卡 那霉素和X－gal 无 目的基因破坏了LacZ 基因的结构，LacZ 基因无法表达 ④260 和1 700 解析 (1)由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，因此，根据药物 A 的氨基酸序列人工合成DNA 片段的方法得到的DNA 片段有多种可能。PCR 技术是体外 扩增DNA 的技术，该技术的原理是DNA 的半保留复制。(2)①由于DNA 复制时子链的延 伸是从5′端向3′端延伸，含磷酸基团的一端为5′端，含羟基的一端为3′端，因此两个 引物的设计需要分别根据模板DNA 两条链的3′端进行设计，因此，依据图中目的基因两 侧相关序列，扩增时选用的引物碱基序列为5′－TCTGTT－3′和5′－CTTGGA－3′。 ②目的基因与质粒形成重组质粒通常要有相同的末端，且目的基因应插入启动子和终止子之 间才能在受体细胞中表达。终止子与启动子之间有三种限制酶识别序列：EcoRⅠ、XmaⅠ 和BamHⅠ。据图1 可知，EcoRⅠ会破坏目的基因，故为将目的基因准确插入质粒中，最 好选用XmaⅠ和BamHⅠ切割目的基因。XmaⅠ和BamHⅠ切割得到的是黏性末端，用T4 或E.coli DNA 连接酶处理均可，都可以得到重组质粒。③由图1 可知，质粒中含有LacZ 基 因和卡那霉素抗性基因，在构建基因表达载体时目的基因插入使LacZ 基因被破坏，无法表 达产生相应的产物将无色物质X－gal 催化为蓝色物质，菌落呈无色。因此，在培养基中应 加入的物质有卡那霉素和X－gal，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌才能不被卡那 霉素杀死，同时表现为无色菌落。④根据质粒和目的基因中EcoRⅠ的酶切位点可知，正向 连接后用EcoRⅠ切割，可以得到两个片段分别为400＋700＋600＝1 700(bp)，10＋50＋200 ＝260(bp)，故通过琼脂糖凝胶电泳分离后，可得到长度为1 700 bp 和260 bp 的条带。
